miR-1246在肝癌組織中的表達及其對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響

彭兆意，周喜洋（浙江省天臺縣人民醫院　普外科，浙江　臺州　317200）

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miR-1246在肝癌組織中的表達及其對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響

彭兆意，周喜洋
（浙江省天臺縣人民醫院普外科，浙江臺州317200）

[摘 要]目的 觀察微小RNA-1246（miR-1246）在肝癌組織中的表達及其對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響，探討其在肝癌發生發展中的作用和意義。方法 應用實時定量PCR（qRT-PCR）方法檢測miR-1246在肝癌以及癌旁組織的表達；對人肝癌細胞株（BEL7402、SMMC7721）轉染miR-1246抑制劑后，采用MTT法觀察肝癌細胞的增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。結果 miR-1246在肝癌組織中表達顯著高于癌旁組織[（65.39±8.77）vs（10.23±2.58），P=0.002]。MTT和凋亡實驗結果顯示，與陰性對照組相比，轉染miR-1246抑制劑后，BEL7402細胞增殖能力下降，凋亡增加（P均＜0.05）；SMMC7721細胞也出現增殖能力下降，凋亡增加（P均＜0.05）。結論 miR-1246在肝癌組織中高表達，并且與肝癌細胞的增殖及凋亡有關，其表達的上調可能與肝癌的發生發展有關。

[關鍵詞]微小RNA-1246；癌，肝細胞；增殖；凋亡

Expression of miR-1246 in human hepatocellular carcinoma and its effect on cell proliferation and apoptosis

PENG Zhao-yi,ZHOU Xi-yang.Department of General Surgery,People’s Hospital of Tiantai,Taizhou,Zhejiang 317200,China

Abstract objectiveTo observe the expression of miR-1246 in human hepatocellular carcinoma tissues and its effect on cell proliferation and apoptosis.MethodsThe expression of miR-1246 in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues was detected by real-time PCR(qRT-PCR).The cultured hepatocellular carcinoma cell line BEL7402 and SMMC7721 cells were transfected with miR-1246 inhibitor,the cell proliferation was detected by MTT assay and apoptosis was analyzed by flow cytometry.ResultsThe expression of miR-1246 in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in normal liver tissues[(65.39±8.77)vs(10.23±2.58),P=0.002)].After transfected miR-1246 inhibitor,BEL7402 cell transfected hepatocellular carcinoma cells showed low proliferation rate and high apoptosis rate when compared with control group(P＜0.05),the same trend was also observed in SMMC7721 cells(P＜0.05).ConclusionThese results indicate that the miR-1246 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues and its high expression may be involved in the development of hepatocellular carcinoma.

Key words microRNA 1246(miR-1246); hepatocellular carcinoma; proliferation; apoptosis

微小RNA（miRNAs）是一種小的非編碼RNA，它能與靶mRNA的3′UTR結合，引起靶mRNA的降解或者抑制靶mRNA的翻譯[1]。miRNAs作用十分廣泛，多種生物過程的信號通路受其調控，如細胞增殖、凋亡、應激及脂肪代謝，在腫瘤發生發展上起著重要作用[2]，是目前生命科學領域研究的熱點之一。已有研究證實，miR-1246的異常表達與多種腫瘤發生發展有關，如食管癌、胃癌、卵巢癌等，但其與肝癌的關系少有報道[3]。為探討miR-1246在肝癌發生發展過程中發揮的作用，我們檢測該小分子在臨床肝癌組織以及癌旁組織中的差異表達情況，利用體外細胞學實驗觀察miR-1246對肝癌細胞的增殖和凋亡作用，為進一步探討其在肝癌發生發展中的作用機制奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1組織標本

收集我院2013年3月至2014年3月共35例肝癌患者手術切除的新鮮組織標本，其中男20例，女15例，年齡35～68歲，平均（54.1±6.3）歲。所有患者合并有慢性乙型肝炎病毒感染，術前血清甲胎蛋白（AFP）≥400 ng/mL，腫瘤組織病理類型為肝細胞癌，腫瘤BCLC分期均為A期。肝癌組織：取自實性癌中未壞死的區域。癌旁組織：肝癌周圍2 cm以外的未壞死組織。所有患者術前未行放療、化療以及介入治療。

1.2細胞株及試劑

人肝癌細胞株（BEL7402、SMMC7721）為浙一醫院肝膽外科實驗室饋贈。培養基R/MINI-1640購自Hycolone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司；Taqman microRNA assays購于美國ABI公司；Lipofectamine 2000、Trizol試劑、逆轉錄（RT）試劑盒購自Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。miR-1246抑制劑（5′-CCUGCUCC AAAAAUCCAUU-3′）和抑制劑對照（5′-UUGUACUACAC AAAAGUACUG-3′）購自上海吉瑪公司。

1.3細胞培養及轉染

兩種人肝癌細胞株均用含10%胎牛血清的R/ MINI-1640培養液培養，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中。取對數生長期細胞，按脂質體試劑盒操作說明書進行轉染，實驗細胞分3組：抑制劑組（轉染miR-1246抑制劑）、陰性對照組（轉染miR-1246抑制劑對照）及空白對照組。

1.4qRT-PCR

收取細胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織標本則加入1 mL Trizol后用勻漿器研磨，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min后，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預冷的異丙醇置于-20 ℃ 30 min，再用12 000 r/min，4 ℃離心15 min后棄上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 1000（美國）檢測總mRNA濃度。根據逆轉錄試劑盒操作，制備cDNA產物，以U6為內參，以逆轉錄產物為模板，在實時定量PCR儀（First7500美國）上進行PCR擴增。PCR擴增體系：10 μL 2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix、20 μmol/L的正反鏈引物各1 μL，4 μL逆轉錄產

2 結果

2.1肝癌組織中miR-1246的表達情況

通過RT-PCR技術分別檢測肝癌組織和癌旁組織中miR-1246的表達，結果顯示相對于癌旁組織（10.23± 2.58），肝癌組織（65.39±8.77）的miR-1246表達上調（P=0.002）。

2.2miR-1246抑制劑對肝癌細胞系增殖能力的影響

將BEL7402、SMMC7721細胞分別轉染miR-1246抑制劑和miR-1246抑制劑對照，通過MTT比色法檢測570 nm處不同轉染處理后OD值，見表1。與陰性對照組和空白對照組比，BEL7402細胞株和SMMC7721細胞株轉染抑制劑組OD值明顯下降，差異有統計學意義（P ＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明抑制miR-1246后能夠抑制肝癌細胞的增殖。物，加滅菌雙蒸水至總反應體積20 μL。反應條件為：95 ℃預變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ l0 s，共40個循環，采用相對定量方法計算靶miRNA相對表達量。

1.5MTT檢測細胞增殖情況

將轉染后的肝癌細胞接種于96孔板（5 000個細胞/孔）后繼續培養，分別于24、48、72、96 h加入20 μL的MTT試劑（5 mg/L），在37 ℃恒溫孵育箱中孵育4 h，吸出液體后加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，在酶標儀570 nm波長處測定吸光度（OD）值。每組實驗重復3次。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

將轉染后24 h后的肝癌細胞更換為無血清培養基，置于1% CO2，37 ℃培養箱繼續培養48 h。收集細胞后加入5 μL Annexin V和5 μL PI，混勻，室溫下避光孵育30 min，然后送流式細胞儀（美國BD公司）檢測。每組實驗重復3次。

1.7統計學分析

表1　轉染72 h后各組細胞的OD值比較

2.3miR-1246抑制劑對肝癌細胞系凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果如圖1、表1所示，與陰性對照組和空白對照組比，BEL7402細胞株和SMMC7721細胞株轉染抑制劑組凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明抑制miR-1246能促進肝癌細胞凋亡。

圖1　BEL7402細胞株凋亡圖

表2　各組細胞凋亡率（%，Q2+Q4）的比較

3 討論

原發性肝細胞癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率僅次于食管癌和胃癌之后位于第三位，而且在癌癥導致死亡中高居第三位[4]。miRNAs已被證實廣泛參與體內多種生理或病理生理過程，包括腫瘤的發生發展在內。miRNAs可以通過調節其靶mRNA的表達，發揮促進或者抑制腫瘤進展的作用[5-7]。大量的研究已經證實，原發性肝癌組織中可以檢測到許多特異性的miRNAs分子，其中就包括miR-1246，由于其是轉錄后水平調控基因表達的關鍵因子，因此研究該小分子在肝癌發生發展中的作用，對更加深入了解肝癌的發病機制以及新的抗癌藥物的研發具有重要意義[8-10]。miR-1246為眾多小分子RNA中的一員，在多種疾病及生理過程中均發揮重要作用。日本學者Takeshita等利用microRNA芯片篩選技術對食管鱗癌的患者血清與正常人血清行miRNAs芯片篩選，發現miR-1246表達上調，并且發現miR-1246的表達上調與臨床病理特征相關，可以作為食管鱗癌的一個診斷和預后指標[11]，還有報道顯示miR-1246可作為卵巢癌患者預后指標[12]。

我們的研究結果顯示，肝癌組織中miR-1246的表達顯著高于癌旁組織，提示與腫瘤發生發展有關；體外細胞實驗發現抑制miR-1246后肝癌細胞增殖能力下降，凋亡增多，提示該小分子RNA與腫瘤細胞的增殖、凋亡緊密相關。這與陳軍瑩等[13]的研究結果一致。關于miR-1246的靶基因，目前尚未明確，有報道其是p53家族的靶基因，當細胞受到損傷時，p53基因誘導miR-1246的表達，下調Dyrkla A（一種唐氏綜合征相關的蛋白激酶）的基因表達，從而使其底物NFATcl的表達增加，導致細胞凋亡減少，在敲除p53基因則可起到相反的作用，這提示著p53基因可以通過miR-1246而發揮抑制腫瘤的作用，miR-1246可能與腫瘤的發生相關[14-15]。miR-1246的功能可能還涉及其他靶基因或信號途徑的作用，需要進一步研究。

通過本研究，我們發現了miR-1246在肝癌組織中表達增高，且與肝癌細胞的增殖、凋亡有關，提示該小分子RNA在肝細胞癌的發生發展過程中起著正調控的作用，它可能作為肝細胞癌惡性行為的重要標志，同時也可能為治療及預后提供參考，關于該小分子在肝癌的分級分期中的意義及與預后的關系值得進一步研究。

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（本文編輯：張和，魯翠濤）

作者簡介][第一彭兆意（1973-），男，江西吉安人，主治醫師，碩士。

[基金項目]浙江省臺州市科技項目（100KY-58）。

[收稿日期]2015-07-17

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.003