蛋白酶體抑制劑MG132對膽囊癌細胞殺傷作用的實驗研究

朱衛平，詹棣華，趙一鳴，王魯，解宏偉，王會鵬，程志儉（.復旦大學附屬上海市第五人民醫院　普外科，上海　0040；.復旦大學附屬腫瘤醫院　肝臟外科，上海0003）

?

蛋白酶體抑制劑MG132對膽囊癌細胞殺傷作用的實驗研究

朱衛平1，2，詹棣華2，趙一鳴2，王魯2，解宏偉1，王會鵬1，程志儉1
（1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院普外科，上海200240；2.復旦大學附屬腫瘤醫院肝臟外科，上海200032）

[摘 要]目的 研究蛋白酶體抑制劑MG132抑制膽囊癌細胞增殖及誘導凋亡的機制。方法 采用CCK8和流式細胞術檢測膽囊癌細胞增殖及凋亡情況；采用Western blotting和RT-PCR檢測凋亡相關基因Caspase-8、Caspase-3和DR5的mRNA和蛋白質表達；建立荷瘤裸鼠模型，觀察MG132干預下裸鼠瘤重及瘤體積的變化。結果 在本研究中發現MG132能有效抑制體外和體內膽囊癌細胞的增殖，其作用呈劑量依賴性（P＜0.01）。MG132能促使膽囊癌細胞發生G2/M期阻滯及誘導細胞凋亡。MG132誘導膽囊癌細胞凋亡主要通過激活外源性凋亡通路中DR5、Caspase-8和Caspase-3過表達。結論 MG132能對膽囊癌細胞起殺傷作用，其機制可能通過影響細胞周期阻滯及誘導細胞凋亡起作用。

[關鍵詞]膽囊癌；蛋白酶體抑制劑；增殖；凋亡

Experimental study of the killing effect of proteasome inhibitor MG132 on gallbladder cancer cells

ZHU Wei-ping1,2,ZHAN Di-hua2,ZHAO Yi-ming2,Wang Lu2,Xie Hong-wei1,Wang Hui-peng1,Cheng Zhi-jian1.1Department of General Sugery,the Fifth People’s Hospital of Shanghai,Fudan University,Shanghai 200240,China;2Department of Hepatic Surgery,Fudan University Shanghai Cancer Center,Shanghai,200032,China

Abstract objectiveTo investigate the mechanism of proteasome inhibitor MG132 in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of gallbladder cancer cells.MethodsThe anti-tumor activity of MG132 on gallbladder cancer cells was assessed by the CCK8 assay.Apoptosis changes were detected by flow cytometric analysis.The protein and mRNA expression of Caspase-8,Caspase-3 and DR5 were examined using Western blotting and RT-PCR.Gallbladder cancer xenografts in athymic nude mice were established and the tumor weight and volume were measured after the intervention of MG132.ResultsThe results showed that MG132 inhibited the proliferation of gallbladder cancer cells in a dose-dependent manner both in vivo and in vitro(P＜0.01).Exposure of tumor cells to MG132 induced cell cycle arrest at G2/M phase and apoptosis in a dose- dependent manner(P＜0.01).In addition,analysis of apoptotic pathways indicated that MG132 significantly enhanced the activation of Caspase-8,Caspase-3 and DR5 in extrinsic signaling pathway(P＜0.05).ConclusionProteasome inhibitor MG132 can effectively kill gallbladder cancer cells and its mechanism involves the cell cycle arrest and apoptosis induction.

Key words gallbladder carcinoma; proteasome inhibitor; proliferation; apoptosis

膽囊癌是高度惡性的膽道系統腫瘤，目前雖然隨著診斷技術和治療手段的提高使得患者預后有所改善，但5年生存率仍然低于5%[1]。因此，積極探索膽囊癌治療的新策略成為目前研究的重點。泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是調控真核細胞中內源性蛋白質選擇性降解的關鍵途徑，與腫瘤細胞的周期運轉、增殖、凋亡等生物學行為密切相關[2]。MG132是一種可逆性醛基肽類特異性蛋白酶體抑制劑，能通過抑制26S蛋白酶體對泛素結合蛋白的降解，阻斷UPP介導的蛋白質的降解，影響細胞周期進程和誘導細胞凋亡[3]。本實驗主要探討蛋白酶體抑制劑MG132抑制膽囊癌細胞增殖及誘導凋亡的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料

人膽囊癌細胞株（GBC-SD）購自復旦大學腫瘤研究所。MG132（Z-Leu-Leu-Leu-al）、Caspase-8、Caspase-3、DR5購自Sigma公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所；酶標儀（TECAN公司）；FACScan型流式細胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞增殖檢測：GBC-SD細胞傳代培養于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，37 ℃、5% CO2培養箱。予以不同濃度MG132（0、2.5、5、10、20 μmol/L）作用24、48及72 h。酶標儀450 nm波長下檢測吸光度并繪制細胞存活率曲線。根據檢測的細胞存活率，選擇合適后續實驗的處理濃度和處理時間。

1.2.2細胞周期分析：收集對數生長期GBC-SD細胞，予以預設MG132濃度（0、2.5、5、10 μmol/L）處理72 h，調整細胞數量至1×106個/mL。4%多聚甲醛固定。100 μL碘化丙啶（PI）工作液（0.5 mg/mL的PI，0.2 mg/mL的RNaseA），4 ℃避光染色30 min。轉至流式檢測管，上機檢測。

1.2.3細胞凋亡檢測：取對數生長期細胞，不同預設濃度MG132作用72 h。消化、離心細胞，棄上清（重復兩次）；預冷無水乙醇固定后重懸于0.5 mL的PI染液（含有10 μg/mL pI和50 μg/mL Rnase A），37 ℃30 min。用凋亡試劑盒對上述細胞進行染色處理，流式上機檢測上述細胞凋亡情況。

1.2.4蛋白表達檢測：采用Western blotting法在6孔板中接種1×106個/mLGBC-SD細胞，貼壁培養12 h。予以預設不同濃度MG132作用72 h。使用RIPA裂解液提取各組蛋白，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉PVDF膜。用10%胎牛血清4 ℃封閉過夜后，一抗結合孵育2 h。TBST洗2遍后加入熒光二抗，37 ℃搖床孵育1 h。紅外激光成像系統進行蛋白質分析。

1.2.5mRNA表達檢測：采用RT-PCR法不同濃度MG132作用GBC-SD細胞72 h后，檢測細胞Caspase-8、 Caspase-3、DR5 mRNA的表達。反應引物序列如表1。Trizol試劑提取細胞總RNA，根據RNA逆轉錄試劑盒說明反轉錄cDNA。使用即時熒光定量PCR儀（7300，ABI）進行擴增反應。取PCR產物6 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳。應用Quantity One software（Bio-Rad Inc）分析電泳結果并進行灰度掃描。

表1　RT-PCR反應引物序列

1.2.6荷瘤裸鼠實驗：取對數生長期GBC-SD細胞，建立裸鼠膽囊癌皮下模型。將實驗模型隨機分為4組：對照組（生理鹽水），MG132低劑量組（5 mg/kg），MG132中劑量組（10 mg/kg），MG132高劑量組（15 mg/kg）。成模后第10天開始連續腹膜腔注射至3周。每3 d觀察各小鼠的腫瘤體積，第22天處死實驗小鼠，觀察瘤重。

1.3統計學分析

2 結果

2.1細胞存活率觀察

從圖1可知，MG132能明顯抑制膽囊癌細胞GBCSD的存活率，呈濃度和時間依賴關系（P＜0.01）。當濃度區間在0～10 μmol/L時，隨著MG132濃度增大，GBC-SD細胞存活率下降最明顯，故后繼實驗選擇較低濃度MG132（0、2.5、5、10 μmol/L）在72 h進行實驗觀察。

2.2細胞周期分析

從圖2可知，不同濃度MG132作用GBC-SD細胞72 h后，GBC-SD細胞發生G2/M期阻滯并且凋亡細胞數明顯增加，其效應在10 μmol/L組最明顯，呈量效關系（P＜0.01）。

圖1　不同濃度MG132在不同時間對膽囊癌細胞存活率的影響

2.3細胞凋亡分析

流式結果顯示，MG132能濃度依賴性的誘導膽囊癌細胞GBC-SD發生凋亡，差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖3）。在細胞凋亡信號通路檢測中，Western blotting結果顯示隨著MG132濃度的增加，膽囊癌細胞表達凋亡蛋白DR5、Caspase-8、Caspase-3水平出現明顯增強，呈劑量依賴性（P＜0．05）（圖4）。RTPCR結果顯示MG132能明顯增強GBC-SD細胞中外源性凋亡通路DR5、Caspase-8、Caspase-3 mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0．05）。

2.4荷瘤裸鼠體內實驗分析

體內實驗發現，MG132能劑量依賴性的抑制膽囊癌GBC-SD的生長。膽囊癌移植瘤重量從（1.132± 0.125）g（對照組）、（0.876±0.132）g（5 mg/kg組）、（0.706±0.123）g（10 mg/kg組）逐漸減少至（0.424± 0.032）g（15 mg/kg組），組間差異具有統計學意義（P ＜0.01）。同時，移植瘤的體積也隨MG132處理劑量的逐漸增大而逐漸縮小，呈劑量依賴性（P＜0.01）。

圖2　不同濃度MG132對膽囊癌細胞周期的影響

圖3　不同濃度MG132對膽囊癌細胞凋亡的影響

圖4　不同濃度MG132對膽囊癌細胞凋亡蛋白表達影響

3 討論

目前研究發現，泛素-蛋白酶體通路（UPP）可高效并高度選擇性降解與細胞周期、凋亡等相關的各種蛋白質，啟動相關信號通路對細胞蛋白的調節，是極有潛力的控制細胞凋亡的靶點[4-5]。蛋白酶體抑制劑MG132可以通過阻斷UPP對異常蛋白的降解，影響細胞周期，誘導細胞凋亡，增強藥物敏感性[6-7]。MG132在消化道腫瘤中的研究已逐漸成為研究熱點。已有文獻報道在結直腸癌、肝癌細胞株中，蛋白酶體抑制劑MG132能以時間和劑量依賴性的方式抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[8-9]。然而，蛋白酶體抑制劑在膽囊癌中的研究沒有得到足夠重視，研究的數據也非常有限。在本實驗中，我們通過體內外實驗發現在不同濃度MG132干預下，膽囊癌細胞存活率呈現劑量依賴性。這提示在膽囊癌細胞中，MG132也能通過阻斷UPP途徑抑制細胞增殖。

在進一步研究中，我們發現MG132能劑量依賴性地促進膽囊癌細胞發生G2/M期阻滯及誘導細胞凋亡，這些結果提示MG132對膽囊癌細胞的殺傷作用主要是通過影響細胞周期阻滯及誘導細胞凋亡起作用。楊洋等[10]的研究也證明，MG132在食管鱗癌中也能通過抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，提高順鉑的殺傷作用。細胞凋亡主要通過內源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑。既往研究發現在細胞凋亡過程中，細胞膜上死亡受體DR5和DR4能與TRAIL配體結合啟動外源性凋亡信號通路，發揮促凋亡的作用[11]。目前，DR5 和DR4已成為細胞凋亡調控研究中的熱點。外源性TRAIL通過與腫瘤細胞膜上DR5和DR4受體結合發揮強大的腫瘤細胞殺傷作用已被較多實驗所證實，顯示出較大的臨床應用價值，但同時也發現部分腫瘤細胞存在耐藥現象。有文獻報道UPP途徑能通過影響死亡受體介導的細胞凋亡通路調控細胞凋亡[12]。在本研究中，我們觀察到不同濃度MG132作用下，膽囊癌細胞內DR5蛋白及基因表達出現明顯的增強，同時DR5下游凋亡通路中關鍵分子caspase-8及caspase-3表達水平也出現明顯上調，說明MG132可通過阻斷UPP途徑影響DR5介導的外源性凋亡通路發揮腫瘤細胞殺傷作用。隨著DR5及DR4成為抗腫瘤治療及耐藥機制研究的焦點，本實驗機制的闡明將為聯合用藥克服抗腫瘤耐藥提供新的思路。在后期實驗中，我們將在現已探明的MG132作用機制基礎上進一步探索MG132與TRAIL聯合運用增強TRAIL抗膽囊癌療效的作用及具體機制。這些作用機制的闡明將為TRAIL聯合治療抗腫瘤，克服腫瘤細胞耐藥提供新的方向。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑MG132能有效抑制膽囊癌細胞的增殖，其作用呈劑量-時間依賴關系。MG132對膽囊癌細胞的化療殺傷作用，其過程涉及細胞周期阻滯及DR5介導的外源性凋亡通路。

參考文獻：

[1]BIZAMA C,GARCIA P,ESPINOZA J A,et al.Targeting specific molecular pathways holds promise for advanced gallbladder cancer therapy[J].Cancer Treat Rev,2015,41(3):222-234.

[2]DING F,XIAO H,WANG M,et al.The role of the ubiquitinproteasome pathway in cancer development and treatment[J].Front Biosci(Landmark Ed),2014,19:886-895.

[3]GUO N,PENG Z.MG132,a proteasome inhibitor,induces apoptosis in tumor cells[J].Asia Pac J Clin Oncol,2013,9(1):6-11.

[4]VAN KERKHOF P,ALVES DOS SANTOS C M,SACHSE M,et al.Proteasome inhibitors block a late step in lysosomal transport of selected membrane but not soluble proteins[J].Mol Biol Cell,2001,12(8):2556-2566.

[5]NALEPA G,ROLFE M,HARPER J W.Drug discovery in the ubiquitin-proteasome system[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(7):596-613.

[6]YUAN B Z,CHAPMAN J,DING M,et al.TRAIL and proteasome inhibitors combination induces a robust apoptosis in human malignant pleural mesothelioma cells through Mcl-1 and Akt protein cleavages[J].BMC Cancer,2013,13:140.

[7]ZANOTTO-FILHO A,DELGADO-CANEDO A,SCHRODER R,et al.The pharmacological NFkappaB inhibitors BAY117082 and MG132 induce cell arrest and apoptosis in leukemia cells through ROS-mitochondria pathway activation[J].Cancer Lett,2010,288(2):192-203.

[8]DING W X,NI H M,CHEN X,et al.A coordinated action of Bax,PUMA,and p53 promotes MG132-induced mitochondria activation and apoptosis in colon cancer cells[J].Mol Cancer Ther,2007,6(3):1062-1069.

[9]CERVELLO M,GIANNITRAPANI L,LA ROSA M,et al.Induction of apoptosis by the proteasome inhibitor MG132 in human HCC cells:Possible correlation with specific caspasedependent cleavage of beta-catenin and inhibition of betacatenin-mediated transactivation[J].Int J Mol Med,2004,13(5):741-748.

[10]楊洋,樊玉霞,劉東雷,等.蛋白酶體抑制劑MG132增加順鉑對食管鱗癌細胞的殺傷作用[J].中華實驗外科雜志,2014,31(5):1042-1044.

[11]PAN G,O’ROURKE K,CHINNAIYAN A M,et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].Science,1997,276(5309):111-113.

[12]SONG J J,SZCZEPANSKI M J,KIM S Y,et al.c-Cbl-mediated degradation of TRAIL receptors is responsible for the development of the early phase of TRAIL resistance[J].Cell Signal,2010,22(3):553-563.

（本文編輯：張海燕，魯翠濤）

·論著 基礎研究·

[通訊作者簡介]王魯，教授，博士生導師，E-mail：wang.lu@zs-hospital.sh.cn。

作者簡介][第一朱衛平（1980-），男，江蘇常州人，主治醫師，博士。

[基金項目]國家自然科學基金項目（81372314，81272393）；上海市衛生局青年基金項目（20134Y089）；上海市閔行區自然科學基金項目（2012MHZ025）；復旦大學附屬上海市第五人民醫院院內課題（2010QJ05）。

[收稿日期]2015-12-09

[中圖分類號]R735.8

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.008