胰島素對急性重癥膽管炎膿毒癥大鼠骨骼肌代謝的影響

魯葆春，楊建輝，陳志良，林凌，方劍鋒，朱志楊（紹興市人民醫院/浙江大學紹興醫院　肝膽外科，浙江　紹興　312000）

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胰島素對急性重癥膽管炎膿毒癥大鼠骨骼肌代謝的影響

魯葆春，楊建輝，陳志良，林凌，方劍鋒，朱志楊
（紹興市人民醫院/浙江大學紹興醫院肝膽外科，浙江紹興312000）

[摘 要]目的 探討胰島素對大鼠急性重癥膽管炎（ACST）膿毒癥狀態下泛素系統介導骨骼肌蛋白質分解的調理作用。方法 20只雄性SD大鼠按月齡、體重同窩飼養，隨機分為假手術組（SO）、ACST膿毒癥模型組（AS）、低劑量胰島素ACST膿毒癥模型組（LIAS，胰島素給予量為2.4 mU·kg(-1)·min(-1)）、高劑量胰島素ACST膿毒癥模型組（HIAS，胰島素給予量4.8 mU·kg(-1)·min(-1)），每組5只。所有大鼠均行正常血糖鉗夾模型制備，并通過調節25%葡萄糖的輸注率（GIR）將血糖維持在5～6 mmol/L的穩態；只有當血糖超過11.9 mmol/L時才需加用胰島素。采用高效液相-色譜分析法檢測伸趾長肌內3-甲基組氨酸（3-MH）；RT-PCR法檢測伸趾長肌內編碼泛素、蛋白酶體C2亞基的mRNA表達變化。結果 AS組大鼠伸趾長肌內3-MH含量為（3.69±0.20）nmol/g，較SO組（2.07±0.13）nmol/g顯著升高（P＜0.001）；且顯著高于HIAS組（2.39±0.21）nmol/g（P＜0.001）和LIAS組（2.87±0.19）nmol/g（P＜0.001）。HIAS組大鼠伸趾長肌內3-MH含量較LIAS組顯著降低（P＜0.001）。AS組大鼠伸趾長肌內泛素mRNA表達較SO組明顯升高，其相對表達量增加了19.70倍。LIAS組泛素mRNA相對表達量為6.96（范圍為4.17～11.67）、HIAS組相對表達量為1.89（范圍為1.43～2.48），與AS組比較均明顯下降（P=0.028，0.009）。HIAS組泛素mRNA表達水平低于LIAS組（P=0.009）。AS組大鼠伸趾長肌內蛋白酶體C2亞基mRNA表達較SO組明顯升高，其相對表達量增加了191.34倍。LIAS組蛋白酶體C2亞基mRNA相對表達量為31.12（15.74～61.39）、HIAS組蛋白酶體C2亞基mRNA相對表達量為7.67（4.08～14.50），與AS組比較表達均明顯下降（P值均為0.009）。HIAS組C2亞基mRNA表達水平低于LIAS組（P=0.009）。結論 急性重癥膽管炎膿毒癥狀態下，胰島素可抑制骨骼肌蛋白降解，該作用可能是在基因水平通過抑制泛素-蛋白酶體通路表達和活化而實現的。

[關鍵詞]急性重癥膽管炎；膿毒癥；胰島素；泛素；骨骼肌；蛋白代謝；大鼠

Effect of insulin on metabolism of the skeletal muscles in acute cholangitis of severe type rats with sepsis

LU Bao-chun,YANG Jian-hui,CHEN Zhi-liang,LIN Ling,FANG Jian-feng,ZHU Zhi-Yang.Department of Hepatobiliary Surgery,Shaoxing People′s Hospital,Zhejiang University Shaoxing Hospital,Shaoxing,Zhejiang 312000,China

Abstract objectiveTo study the function of insulin on ubiquitin-proteasome induced skeletal muscles proteolysis during acute cholangitis of severe type(ACST)in rats.MethodsTwenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(SO group),ACST sepsis group(AS group),low-dose insulin ACST sepsis group(LIAS group,2.4 mU·kg-1·min-1),and high-dose insulin ACST sepsis group(HIAS group,4.8 mU· kg-1·min-1),with 5 rats in every group.All rats were performed as euglycemic insulin clamp and kept the plasma glucose level in physiologic range(5～6 mmol/L)through adjusting glucose infusion rate(GIR)of 25% glucose.When the plasma glucose was higher than 11.9 mmol/L,more insulin was used.The concentration of 3 methylhistidine(3-MH)in extensor digitorium longus(EDL)muscles were determined by high performance liquid chromatography.The mRNA levels of ubiquitin and C2 subunit of proteasome in the EDL muscle was evaluated by RT-PCR.ResultsThe concentration of 3-MH in the EDL muscles of AS group was higher(3.69±0.20 nmol/ g),compared with SO group(2.07±0.13 nmol/g,P＜0.001),HIAS group(2.39±0.21 nmol/g,P＜0.001),and LIASgroup(2.87±0.19 nmol/g,P＜0.001).The concentration of 3-MH in HIAS group were decreased significantly,compared with LIAS group(P＜0.001).Ubiquitin mRNA level in EDL muscles of the AS group increased significantly,compared with that in the SO group,with an increase of 19.70 times.The relative expression of ubiquitin mRNA in the LIAS group and HIAS group were 6.96(4.17～11.67)and 1.89(1.43～2.48),which decreased significantly(P=0.028,0.009),compared with AS group.The ubiquitin mRNA expression level of HIAS group was lower than that of LIAS group(P=0.009).The C2 subunits mRNA level in EDL muscles of the AS group increased significantly,compared with that of SO group,with an increase of 191.34 times.The relative expression of C2 subunits mRNA in the LIAS group and HIAS group were 31.12(15.74～61.39)and 7.67(4.081～14.50),which decreased significantly(both P=0.009),compared with AS group.The C2 subunits mRNA expression level of HIAS group was lower than that of LIAS group(P=0.009).ConclusionInsulin can effectively alleviate skeletal muscles proteolysis during ACST induced sepsis in rats.This phenomenon may depend on inhibiting the activity of ubiquitin proteasome pathway at gene level.

Key words acute cholangitis severe type; sepsis; insulin; ubiquitin; muscle skeletal; protein metabolism; rats

急性重癥膽管炎（acute cholangitis severe type，ACST）患者體內存在著細菌易位和腸源性內毒素血癥，呈現骨骼肌高分解代謝，目前在營養支持領域尚無一種有效的防治措施。胰島素本身在體內具有直接調節免疫炎癥反應的作用[1]；并可有效降低嚴重膿毒癥狀態下的骨骼肌蛋白降解率[2]。而泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin proteasome pathway；UPP）是膿毒癥骨骼肌蛋白降解的重要途徑之一，主要由三部分組成：（1）泛素：是標記靶蛋白降解的信號分子；（2）泛素相關酶：包括泛素活化酶（E1）、泛素偶聯酶（E2s）、泛素連接酶（E3s）、泛素鏈延長酶（E4）以及去泛素化酶，其中前三類負責活化，并介導泛素分子與特定靶蛋白結合，隨后在E4的作用下，形成能被蛋白酶體識別的降解信號—泛素鏈，其中E2-14k酶與骨骼肌蛋白降解關系緊密；（3）蛋白酶體：泛素化蛋白的降解場所，其C2亞基為蛋白酶體的中心結構。我們擬通過ACST膿毒癥大鼠模型探討胰島素對膿毒癥狀態下泛素系統的影響機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1動物實驗

選用二級清潔健康Sprague-Dawle（SD）大鼠（浙江省實驗動物中心提供）20只，雄性，體重236～372 g，按月齡、體重同窩予標準顆粒混合飼料（浙江省實驗動物中心提供）喂養，所有大鼠實驗期間禁食，靜脈給予葡萄糖4.5 mg·kg-1·min-1。隨機分為假手術組（SO）、ACST膿毒癥模型組（AS）、低劑量胰島素ACST膿毒癥模型組（LIAS，胰島素給予量為2.4 mU· kg-1·min-1）、高劑量胰島素ACST膿毒癥模型組（HIAS，胰島素給予量4.8 mU·kg-1·min-1），每組5只。

1.1.1大鼠正常血糖鉗夾模型制備[3]：大鼠在ACST模型建立前6 d，行右頸外靜脈置管為血糖檢測采血用，行左頸內動脈置管為造模術中輸液備用。待ACST模型建立后，將胰島素、25%葡萄糖分別用二個微電腦數字式注射泵由頸內動脈泵入，每30 min經頸外靜脈抽血用血糖儀測定血糖濃度，并通過調節25%葡萄糖的輸注率（GIR）將血糖維持在5～6 mmol/L左右；只有當血糖超過11.9 mmol/L時才需加用胰島素。

1.1.2ACST膿毒癥大鼠模型建立[4]：1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉，無菌條件下進人腹腔后，在膽總管距左右肝管匯合處1 cm處離斷膽管，遠端結扎，近端插入直徑0.9 mm的麻醉導管，插入深度6 mm，妥善固定硅膠管后經皮膚穿一小孔置于體外，關腹。確定膽汁排出通暢后，向導管內緩慢注入大腸桿菌內毒素（O55B5）10 mg/kg，再注射空氣0.2 mL，然后用封帽封閉導管。假手術組僅在無菌條件下進入腹腔，鈍性剝離膽總管周圍組織后即關閉腹腔。

1.2儀器和試劑

美國安捷倫（Aglient Technologies 1200 Series）高效液相色譜儀，486紫外檢測器，冷凍真空抽吸系統（北京博醫康實驗儀器有限公司），Waters PICO-TAG分析柱（3.9×300 mm）。RNA提取液、RT-PCR試劑盒以及RT-PCR試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），羅氏ROCHE實時熒光定量PCR儀。甲醇、乙腈為德國Merck公司產品，乙酸鈉為英國BDH公司產品，3-MH為美國Sigma公司產品。

1.3檢測標本

模型建立用藥后12 h分離雙側伸趾長肌，進行離體-80 ℃冰箱凍存待測。

1.4檢測方法

1.4.1高效液相-色譜分析法檢測伸趾長肌內3-甲基組氨酸[5]：大鼠雙側伸趾長肌稱重后，分別移入含500 μL 3%三氯乙酸的2 mL勻漿管內，高速勻漿，勻漿液移入0.5 mL 離心管，14 000 r/min（4 ℃）離心25 min，吸取上清液，待用。取上清液3O μL冷凍干燥，再加5O μL衍生試劑，在室溫下衍生反應20 min后繼續冷凍真空干燥，進樣前以5O μL流動相A液稀釋，進樣2O μL。流動相A：1 000 mL超純水內含9.54 g乙酸鈉，25 mL乙腈，250 μL 10 mmol EDTA，用10%乙酸調pH值為6.50。流動相B：450 mL乙腈加400 mL超純水和150 mL甲醇。衍生試劑：異硫氰酸苯酯（PITC）：甲醇:乙醇:三乙胺:水=1:6:1:1:1。紫外波長254 nm，柱溫46 ℃。

1.4.2RT-PCR檢測伸趾長肌內編碼泛素、蛋白酶體C2亞基的mRNA表達變化：通過Genebank檢索，以Primer 5.0軟件設計大鼠泛素引物序列、作為內參照的大鼠管家基因GAPDH引物序列、大鼠E2-14k和蛋白酶體C2亞基的引物序列，由上海激活生物科技公司合成。引物序列分別如下：（1）泛素（ubiquitin，Ub）：擴增片段為156 bp，5′-TAAGACCATCACCCTCG ATT-3′（正義鏈）；5′-TGGATGTTGTAGTCAGACAGGG-3′（反義鏈）；（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）：擴增片段為309 bp，5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA′-3（正義鏈）；5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′（反義鏈）；（3）蛋白酶體C2亞基：其擴增片段為234 bp，5′-AGCAAGGCTCA GCGACAG-3′（正義鏈），5′-GGCGAGATACGGGAAGTG-3′（反義鏈）。具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.5統計學分析

采用SPSS11.0軟件進行多組間單因素方差分析，計量資料以（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；而mRNA相對表達量數據呈偏態分布，故采用中位數結合范圍表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1伸趾長肌內3-MH含量的變化

AS組大鼠伸趾長肌內3-MH含量為（3.69±0.20）nmol/g，較SO組（2.07±0.13）nmol/g顯著升高（P= 0.000）；顯著高于HIAS組（2.39±0.21）nmol/g（P= 0.000）和LIAS組（2.87±0.19）nmol/g（P＜0.001）。HIAS組大鼠伸趾長肌內3-MH含量，較LIAS組顯著降低（P＜0.001）。具體見表1。

表1　大鼠伸趾長肌內3-MH含量（n=5，±s）

2.2伸趾長肌內泛素mRNA表達變化

AS組大鼠伸趾長肌內泛素mRNA表達較SO組明顯升高，其相對表達量增加了19.79倍。LIAS組、HIAS組與AS組比較泛素mRNA表達均明顯下降（P=0.028，0.009）。HIAS組泛素mRNA表達水平低于LIAS組（P= 0.009），表明泛素活性抑制水平與胰島素的量效關系。具體見表2。

表2　各組伸趾長肌內泛素mRNA相對表達量

2.3伸趾長肌內蛋白酶體C2亞基mRNA表達變化

AS組大鼠伸趾長肌內蛋白酶體C2亞基mRNA表達較SO組明顯升高，其相對表達量增加了191.34倍。LIAS組蛋白酶體C2亞基mRNA相對表達量為31.12（15.74～61.39）、HIAS組蛋白酶體C2亞基mRNA相對表達量為7.67（4.08～14.50），與AS組比較表達均明顯下降，差異有統計學意義（P值均為0.009）。HIAS組蛋白酶體C2亞基mRNA表達水平低于LIAS組（P=0.009）。具體見表3。

3 討論

胰島素一直廣泛應用于臨床治療糖尿病，已有研究證實胰島素本身在體內具有直接調節免疫炎癥反應的作用：（1）抑制體內TNF-α、MIF、MCP-1等炎癥介質的生成；（2）增加內皮等細胞的NO合成，從而降低O2-的毒性作用，減少由刺激引起的大量細胞凋亡；（3）影響單核細胞核內炎癥反應相關因子NF-kB的表達等。Yoneyama等[6]研究觀察過量飲食所致的高血糖膿毒癥大鼠血液中IL-6含量是正常組的3倍，而外源性給予胰島素能明顯抑制炎癥反應。Orellana等[7]研究也表明，內毒素、TNF-a等介質是直接或間接導致骨骼肌蛋白降解的重要誘導或調節因子，抑制炎癥介質NF-κB途徑可有效降低嚴重膿毒癥狀態下的骨骼肌蛋白降解率。本實驗證實胰島素可減少ACST膿毒癥時骨骼肌蛋白的降解率，與文獻一致。

表3　各組伸趾長肌內蛋白酶體C2亞基mRNA相對表達量

UPP通路是真核生物細胞質和細胞核內依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質降解通路，在轉錄水平的調節、蛋白質的降解、蛋白質穩定狀態的調節、程序性細胞死亡、細胞周期的控制和免疫介導等過程中起重要作用，其與膿毒血癥所致肌肉萎縮等密切相關。膿毒癥時骨骼肌蛋白合成受到抑制，有研究表明其中細胞因子起到明顯的蛋白合成抑制作用，如IL-6家族因子抑瘤素M通過UPP調節細胞周期蛋白D1水平誘使骨骼肌細胞停滯在G1期，抑制蛋白合成并誘導凋亡[8]。膿毒癥時骨骼肌蛋白降解增強，有研究發現盲腸結扎穿孔可致膿毒癥大鼠模型肌組織中全蛋白降解率增加50%，而肌纖維蛋白降解增加了近440%。申傳安等[2]研究也發現嚴重燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白降解顯著增強，泛素結合蛋白和泛素基因表達也隨之增加。本實驗顯示ACST膿毒癥大鼠伸趾長肌內3-MH含量較正常大鼠明顯升高，提示ACST膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白的高降解率；同時在基因水平上ACST膿毒癥大鼠UPP活性明顯增強，骨骼肌編碼泛素、蛋白酶體C2亞基的mRNA表達明顯上調，而經胰島素鉗夾正常血糖的ACST膿毒癥大鼠，在基因水平上亦提示UPP活性受到抑制，且泛素、蛋白酶體C2亞基的mRNA表達下調程度與胰島素應用有一定的量效關系。

本實驗揭示了急性重癥膽管炎膿毒癥狀態下，胰島素可抑制骨骼肌降解，該作用可能是通過抑制泛素蛋白酶體通路表達和活化而實現的。由于胰島素強化治療容易導致低血糖反應，需要嚴密的監護，而且本實驗僅就胰島素對早期（12 h）ACST膿毒癥骨骼肌高降解的影響進行了研究，遠期療效仍需進一步觀察。臨床上如何應用胰島素調理膿毒癥等嚴重應激狀態下的骨骼肌高分解代謝，仍需進一步探討。

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（本文編輯：張和，魯翠濤）

·論著 基礎研究·

[中圖分類號]R575.7

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.009

作者簡介][第一魯葆春（1971-），男，浙江紹興人，主任醫師。

[基金項目]浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2011C33023）。

[收稿日期]2015-08-06