酸性成纖維細胞生長因子保護慶大霉素對海馬星形膠質細胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機制①

沈　麗，黃巨恩，黃太萍，沈　慧，李校堃

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酸性成纖維細胞生長因子保護慶大霉素對海馬星形膠質細胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機制①

沈麗1，黃巨恩1，黃太萍1，沈慧1，李校堃2

[摘要]目的探討酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)對慶大霉素損傷的海馬星形膠質細胞保護作用可能的機制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠分離、純化海馬星形膠質細胞，膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色鑒定，傳3代細胞接種于24孔培養板培養3 d，分為3組：對照組正常培養，損傷組以2.0 g/L慶大霉素培養24 h，保護組加入4.25 μg/L aFGF培養24 h后再加入2.0 g/L慶大霉素培養24 h。Western blotting檢測P38、細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)1、ERK2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1、JNK2的表達。結果成功培養細胞，純度>95％。與對照組比較，損傷組ERK1表達增加(P<0.05)；保護組與損傷組比較，P38表達增加(P<0.05)，ERK1表達減少(P<0.05)；其余兩兩比較均無顯著性差異(P>0.05)。結論信號通路中的P38和ERK1可能在aFGF對抗慶大霉素誘導的海馬星形膠質細胞損傷過程中發揮作用。

[關鍵詞]酸性成纖維細胞生長因子；分裂原活化蛋白激酶；慶大霉素；星形膠質細胞；海馬；大鼠

[本文著錄格式]沈麗，黃巨恩，黃太萍，等.酸性成纖維細胞生長因子保護慶大霉素對海馬星形膠質細胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機制[J].中國康復理論與實踐,2016,22(3):270-273.

CITED AS:Shen L,Huang JE,Huang TP,et al.Effects of acidic fibroblast growth factor on hippocampal astrocytes injury induced by gentamicin:role of mitogen-activated protein kinase signal pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):270-273.

作者單位：1.廣西醫科大學護理學院，廣西南寧市530021；2.溫州醫學院生物與天然藥物研究院，浙江溫州市325027。作者簡介：沈麗(1987-)，女，漢族，湖北十堰市人，碩士研究生，護師，主要研究方向：創傷護理。通訊作者：黃巨恩，男，廣西南寧市人，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：創傷護理。E-mail:hje5810@163.com。

酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)是一種具有多方面功能的活性蛋白，多存在于腎臟和腦組織中，是血管內皮細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角膜細胞、神經細胞及星形膠質細胞等生長的刺激因子，對來源于中胚層和神經外胚層的細胞具有廣泛的生物學效應[1]。

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能損害神經系統和腎臟；神經元損傷前會使星形膠質細胞受損[2-3]。本研究建立海馬星形膠質細胞損傷模型，在之前研究的基礎上[4-6]，檢測分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路中的P38、細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1、ERK2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)1、JNK2的表達情況，研究MAPK信號通路在aFGF對慶大霉素誘導的海馬星形膠質細胞保護作用過程中的機制。

1材料和方法

1.1材料

新生24 h內Sprague-Dawley大鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(桂)2012-0002。DMEM-HG、胎牛血清由維森特公司提供。胰蛋白酶由美國GIBCO公司提供。抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體由ABCAM公司提供。抗兔二抗由中杉金橋公司提供。硫酸慶大霉素由廣東南國藥業有限公司提供。aFGF由暨南大學生物工程研究所提供，批號20130401。磷酸酶抑制劑、BCA法蛋白含量檢測試劑盒由南京凱基生物發展有限公司提供。蛋白預染Marker由美國THERMO公司提供。RIPA裂解液、一抗稀釋液由碧云天公司提供。HRP標記的GAPDH優質內參(1∶10000)由上海康成生物提供。顯影粉由天津市世紀奧博商貿有限公司提供。

酶標儀為賽默飛世爾(上海)儀器有限公司產品。電泳儀為北京百晶生物技術有限公司產品。高速離心機為珠江黑馬公司產品。超聲儀細胞破碎儀為寧波新芝生物科技股份有限公司產品。暗室燈、暗匣為廣東粵華醫療器械廠有限公司產品。

1.2方法

1.2.1海馬星形膠質細胞的分離和培養

采用黃太萍等星形膠質細胞培養方法[7]。新生大鼠分離出海馬組織，剔除腦膜、血管，將海馬組織剪成小塊，轉入離心管中，加入37℃復溫30 min，終濃度為0.125％的胰蛋白酶，恒溫水浴15 min消化，含10％胎牛血清DMEM-HG培養液終止。1000 r/min離心5 min，棄上清。5×105/ml接種于含10％胎牛血清的DMEM-HG培養液中。37℃、5％ CO2培養箱中培養7～9 d；待細胞70％～80％匯合時傳代純化，傳至第3代的細胞用于實驗。

1.2.2海馬星形膠質細胞的鑒定

將傳3代的細胞接種在6孔板內，置于培養箱中24 h貼壁后，以4％多聚甲醛固定，PBS漂洗。加入1 ∶200兔抗GFAP多克隆抗體，4℃孵育過夜，加入二抗，PBS洗3遍(按試劑盒說明書操作)。加入DAPI染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，共聚焦顯微鏡下觀察顯色結果，陽性細胞胞質呈綠色熒光。取5個不同的視野，計數陽性細胞占所有細胞的比例。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.3 Western blotting檢測

將傳3代處于對數生長期的細胞接種于24孔培養板培養3 d，分為對照組、損傷組和保護組。對照組正常培養；損傷組加入2.0 g/L慶大霉素培養24 h；保護組加入4.25 μg/L aFGF培養24 h后，再加入2.0 g/L慶大霉素培養24 h。

常規提取細胞蛋白。分別收集各組細胞，1000 r/min離心5 min，去上清，向細胞沉淀中加入RIPA裂解液，4℃裂解；1000 r/min離心5 min，取上清液至新離心管中。BCA法測定蛋白濃度。80 V恒壓電泳至溴酚藍至分離膠，120 V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部，4℃轉膜2 h，封閉2 h，加入兔抗大鼠P38、ERK1、ERK2、JNK1、JNK2一抗(1∶1000)，二抗(羊抗兔IgG，1∶20000)，37℃孵育，ECL染色，壓片曝光顯影，定影。采用Lab Works 4.6圖像分析軟件采集圖像，以HRP標記的GAPDH為內參，Quantity One記算各組目的蛋白及內參蛋白的灰度比值。

1.3統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件分析處理。多組均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK q檢驗。顯著性水平α=0.05。

2結果

2.1鑒定

培養24 h后可觀察到大部分細胞貼壁且折光性較好，部分細胞伸展并長出細小突起。培養3～5 d后細胞數目增多，細胞胞體變大，分支增多且突起相互交織成網狀。培養7～10 d后細胞基本匯合并鋪滿瓶底。進行傳代純化得到第3代細胞。GFAP免疫熒光染色可見星形膠質細胞胞質呈綠色熒光，陽性細胞比例>95％，可用于下一步實驗研究。

2.2 Western blotting檢測

對照組較損傷組ERK1表達增加(P<0.05)，保護組較損傷組P38表達增加、ERK1表達減少(P<0.05)。其余蛋白兩兩比較均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　Western blotting檢測各組蛋白的表達(相對灰度)

3討論

大鼠海馬星形膠質細胞的培養受很多因素的影響。實驗發現之前的方法[8-11]培養的細胞質量不高，采用黃太萍等[7]胰蛋白酶消化組織塊分離培養法獲得純度高、生長狀態好且成本較低的星形膠質細胞。我們既往的研究[4-6]證明，4.25 μg/L aFGF能保護慶大霉素誘導的海馬星形膠質細胞操作，因此本實驗亦采用4.25 μg/L aFGF。

星形膠質細胞廣泛存在于哺乳動物腦內，能調節神經元代謝，參與腦損傷后的修復過程以及記憶的形成過程，具有營養、支持神經元的功能，在脊髓損傷早期起修復作用，晚期對損傷修復有抑制作用[12-16]。星形膠質細胞與神經元的相互作用對中樞神經系統內環境穩態、可塑性以及神經信息傳遞、誘導神經干細胞增殖分化有較大影響[17-19]。

aFGF是強促有絲分裂原，具有促有絲分裂和非促有絲分裂兩大類型生物學活性，不僅可促進組織細胞分裂、增殖，還能促進創傷修復，舒張血管，保護神經、心肌、局部缺血等[20-24]。

MAPK是一組能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。哺乳動物細胞MAPK通路主要包括P38 MAPK通路、ERK通路和JNK通路[25]。ERK蛋白條帶分為ERK1和ERK2兩個亞帶，JNK蛋白條帶也分為JNK1和JNK2兩個亞帶。研究表明，P38通路和JNK通路在炎癥反應、神經系統進行性病變和細胞凋亡中發揮重要作用[26]。ERK信號通路參與調節有絲分裂、增殖、分化和哺乳動物細胞發育的過程[27]。MAPK通路參與調節多種重要的細胞生理、病理過程，促進神經損傷的修復[28]。

aFGF的生物學功能與MAPK信號轉導通路以及受體的結合有著密切關系。aFGF促進大鼠腸上皮細胞增殖，與其激活MAPK信號通路有關[29]。aFGF通過ERK途徑將信號導入細胞內，引起特定的生物學效應，發揮保護神經元和促進細胞增殖的作用[30-31]。aFGF啟動的MAPK信號通路對多種細胞趨化應答、分化、分裂起重要作用，尤其在神經細胞和成纖維細胞的生長發育方面，是細胞增殖、分化等信息傳遞途徑的交集點和共同通路[32]。

本實驗通過體外培養的海馬星形膠質細胞建立藥物損傷模型，研究aFGF對慶大霉素誘導的海馬星形膠質細胞損傷保護作用過程中的機制，為臨床上安全有效使用氨基糖苷類藥物奠定基礎。本研究顯示，慶大霉素可能通過激活ERK1損傷海馬星形膠質細胞；aFGF可能通過P38和ERK1途徑對慶大霉素誘導的海馬星形膠質細胞發揮保護作用。ERK2、JNK1、JNK2途徑意義不明顯。

aFGF的保護作用是一個復雜的病理生理過程，本研究未進一步研究不同濃度下aFGF的保護作用機制有無變化，以及aFGF是否通過其他的信號通路發揮保護作用。有待在今后的研究中做更深入的探討。

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Effects of Acidic Fibroblast Growth Factor on Hippocampal Astrocytes Injury Induced by Gentamicin:Role of Mitogen-Activated Protein Kinase Signal Pathway

SHEN Li1,HUANG Ju-en1,HUANG Tai-ping1,SHEN Hui1,LI Xiao-kun2
1.School of Nursing,Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021,China;2.Institute of Biological and Natural Medicine of Wenzhou Medical College,Wenzhou,Zhejiang 325027,China

Correspondence to HUANG Ju-en.E-mail:hje5810@163.com

Abstract:Objective To explore the mechanism of the protection of acidic fibroblast growth factor(aFGF)for hippocampal astrocytes from injury induced by gentamicin.Methods Hippocampal astrocytes were isolated from newborn(24 hours)Sprague-Dawley rats,purified,and identified with glial fibrillary acidic protein(GFAP)immunofluorescence.The third generations were cultured for 3 days and divided into 3 groups:control group was cultured routinely,injury group was cultured with 2.0 g/L gentamicin for 24 hours,and protection group was cultured with 4.25 μg/L aFGF for 24 hours and then cultured with 2.0 g/L gentamicin for 24 hours.Western blotting was adopted to detect the expressions of P38,extracellular signal-regulated kinase(ERK)1/2 and c-Jun N-terminal kinase(JNK)1/2.Results Hippocampal astrocytes were culturated successfully with the purity above 95％.The ERK1 increased in the injury group compared with the control group(P<0.05).Compared with the injury group,the p38 increased(P<0.05)and the ERK1 decreased(P<0.05)in the protection group.There was no significant difference among others(P>0.05).Conclusion The mitogen-activated protein kinase signal pathway,especially P38 and ERK1,may associate with the protection of aFGF for hippocampal astrocytes from injury induced by gentamicin.

Key words:acidic fibroblast growth factor;mitogen-activated protein kinase;gentamicin;astrocytes;hippocampus;rats

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-01-06)

基金項目：1.國家“863”計劃課題(No.2004AA2Z3C60)；2.廣西醫療衛生重點科研課題(No.2011046)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.006

[中圖分類號]R595.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)03-0270-04