核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達及相關因素研究①

柏　華，楊　波，余德軍，張啟芳

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核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達及相關因素研究①

柏華1a,1b，楊波1c，余德軍1a，張啟芳2

[摘要]目的探討核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)對癡呆發病的影響。方法2014年1月～2015年10月，用RT-PCR方法檢測16例阿爾茨海默病(AD)患者、22例血管性癡呆(VD)患者和20名年齡相似的健康體檢者外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA水平；ELISA法檢測血清中白細胞介素(IL)-1β和IL-18蛋白水平；收集患者外周血白細胞計數(WBC)和血清總鈣濃度等臨床檢測資料；將NLRP3 mRNA水平分別與IL-1β、IL-18、WBC和鈣濃度進行單因素相關分析。結果NLRP3 mRNA水平由高到低依次為AD組>VD組>健康組(q>11.48,P<0.05)；IL-1β水平AD組高于健康組(q=16.74,P<0.05)，AD組與VD組、VD組與健康組無顯著性差異(P>0.05)；IL-18水平各組間均無顯著性差異(P>0.05)。AD組中，NLRP3 mRNA水平與IL-1β水平(r=0.64)、血清鈣水平(r=0.58)呈正相關，與IL-18、WBC無相關性(P>0.05)。結論NLRP3炎癥小體中相關蛋白或基因表達與AD的發病可能有較大關系，與VD的發病關系不大。

[關鍵詞]阿爾茨海默病；血管性癡呆；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；炎癥；發病

[本文著錄格式]柏華，楊波，余德軍，等.核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達及相關因素研究[J].中國康復理論與實踐,2016,22(3):306-309.

CITED AS:Bai H,Yang B,Yu DJ,et al.Expression of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3 in patients with Alzheimer's disease and vascular dementia and related factors[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):306-309.

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種進行性的大腦變性疾病，是導致老年人癡呆最常見的原因之一。AD主要的病理變化是神經炎性斑塊和神經原纖維纏結，這兩者均可能與大腦中非特異性炎癥的發生有一定關系[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3,NLRP3)在AD發病中的作用越來越引起重視。Heneka等發現，NLRP3在AD患者中由于caspase-1基因高表達而被活化，并有助于APP/PS-1轉基因小鼠大腦老化病灶的形成；通過減少大腦caspase-1和白細胞介素(interleukin,IL)-1β的活性，有助于β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的清除[2]。

血管性癡呆(vascular dementia,VD)也是一種引起老年人群癡呆發生的常見疾病。通常認為梗死或出血的腦組織越多越容易發生VD，發生血管病變的部位與智力關系越密切越容易發展成VD。最近有學者發現，VD患者大腦也有炎癥發生[3]。

模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)在固有免疫反應中有重要作用，NLRP3既是PRR中的重要成員，也是炎癥小體中的重要成分[4]。為了探討AD和VD發病機制的異同，我們比較NLRP3在AD和VD患者中表達的差異。

1資料與方法

1.1一般資料

2014年1月～2015年10月在貴州醫科大學第三附屬醫院神經內科和精神心理科住院的AD患者16例，VD患者22例。

癡呆的診斷由經過培訓的專科醫師按照簡明精神狀態檢查進行評分。參照2011年美國國立老化研究所和阿爾茨海默病協會修訂的NINCDS-ADRDA標準診斷AD，即缺血指數量表(Hachinski Inchemic Score,HIS)評分≤4分，并排除其他大腦變性疾病和代謝障礙性疾病所致的癡呆。參照美國國立神經病與卒中研究所/瑞士神經科學研究國際會議(NINDS-AIREN)制定的診斷標準診斷VD[5]，且HIS評分≥7分。共篩查30例可疑VD患者，22例臨床診斷為VD，其余8例有血管性認知功能障礙，但未達到VD臨床診斷標準。

AD患者中，男性9例，女性7例；平均年齡(68.8±12.1)歲；平均病程(8.5±3.2)年。VD患者中，男性12例，女性10例；平均年齡(67.4±11.8)歲；平均病程(12.6±3.9)年。

在貴州醫科大學第三附屬醫院體檢科方便抽取中老年人20名(健康組)，平均年齡(67.9±10.5)歲。

收集AD組和VD組的血常規檢查資料和血液電解質檢查資料。

本研究獲得貴州醫科大學第三附屬醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 RT-PCR

收集EDTA抗凝血液標本，淋巴細胞分離液(Ficoll)分離外周血單個核細胞(PBMC)，用Trizol試劑盒(INVITROGEN公司)進行抽提細胞總RNA，加入無RNA酶的超純水50 μl溶解RNA。用紫外分光光度計檢測RNA吸光度，計算A280/A260比值約1.9左右。用逆轉錄試劑盒進行cDNA合成，嚴格按試劑盒說明書操作，使用德國FlexCyxler PCR儀。根據GenBank中人肌動蛋白(β-actin)和NLRP3基因設計引物。

NLRP3上游：5'-CTT CCT TTC CAG TTT GCT GC-3'；下游：5'-TCT CGCAGT CCACTT CCT TT-3'

β-actin上游：5'-ATG ATG GCT TAT TAC AGT GGC AA-3'；下游：5'-GTC GGA GAT TCG TAG CTG GA-3'。

95℃30 s預變性，95℃30 s變性，55℃30 s退火，70℃1 min延伸，共36個循環。

擴增產物用含GreenView核酸染料的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀曝光，BIO-RAD Quantity-One軟件測量灰度值，與內參β-actin灰度值的比值代表NLRP3 mRNA表達量。

1.3 ELISA

IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。使用BIO-RAD-680型酶標儀，630/450 nm雙波長測定OD值，以OD值為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制標準曲線并計算樣品濃度。

1.4統計學分析

2結果

2.1各測量指標水平

NLRP3 mRNA表達(圖1)AD組高于健康組(q= 18.23,P=0.003)和VD組(q=15.65,P=0.007)，VD組高于健康組(q=11.48,P=0.024)。IL-1β水平AD組高于健康組(q=16.74,P=0.036)，AD組與VD組、VD組與健康組間均無顯著性差異(P>0.05)；IL-18水平各組間均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

AD組和VD組WBC和血清鈣濃度見表2。

圖1　RT-PCR檢測結果

表1　各組NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18水平比較

表2　AD組和VD組WBC和血清鈣濃度比較

2.2相關性分析

AD組中，NLRP3 mRNA表達與IL-1β(r=0.64)、鈣濃度(r=0.58)呈正相關(P<0.05)，與IL-18或WBC無相關性(P>0.05)；VD組中，NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18、WBC、鈣濃度均無相關性(P>0.05)。見表3。

表3　AD組和VD組NLRP3 mRNA與其他指標的相關性分析

3討論

AD患者以Aβ在大腦海馬中過度沉積和Tau蛋白異常磷酸化為主要發病機理，Aβ的生成和清除失調很可能是AD發病的始動環節或中心事件[6]。過度累積的Aβ通過激活蛋白激酶，促進Tau蛋白磷酸化，引發慢性炎性，激活細胞凋亡，發生氧化應激，最終引起神經細胞變性死亡[7]。目前開發的AD治療藥物主要試圖抑制Aβ炎性斑塊形成，阻止Tau蛋白異常磷酸化。抑制Aβ誘導的炎性反應尤其受到重視。

NLRP3炎性小體是由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白(ASC)和效應蛋白caspase-1組成的大分子復合體[8]。NLRP3炎性小體與固有免疫系統功能的正常發揮有重要關系，如果對其調控失衡，可能導致促炎細胞因子IL-1β和IL-18等大量生成，通過相關信號轉導通路，引發一系列炎癥瀑布反應，最終參與包括AD在內的多種炎癥性疾病的發生和發展[9]。最近有學者發現，Aβ可通過激活小膠質細胞NLRP3炎性小體，導致腦內炎癥反應，引起神經元損傷和死亡，進而引發AD[10]。固有免疫系統作為機體的第一道保護屏障，能夠通過PRR識別病原相關分子，以抵抗外來病原體的入侵和修復機體損傷[11]；NLRP3蛋白作為PRR-NLR家族中的重要成員，能夠識別細胞內的病原體以及細胞自身產生的危險信號，從而保持機體健康。從固有免疫系統角度研究AD的發病機制有重大的病理生理學意義。

本研究提示，NLRP3基因的高表達在AD、VD的發病中均能起一定作用。Murphy等發現，用Aβ處理大鼠神經膠質細胞后，經由組織蛋白酶依賴性的NLRP10降解作用，NLRP3炎癥小體有所形成和活化，其中NLRP3蛋白明顯增加[12]。這一結果提示，NLRP3主要誘發AD發病，而對VD的發生作用可能有限。由于本次檢測樣本量不大，缺乏國外同類資料橫向比較，確切的臨床生物學意義還有待探索。下一步我們還考慮檢測癡呆患者血液中NLRP3蛋白的變化，以比較VD組與AD組的差異。

NLRP3有助于APP/PS-1轉基因小鼠大腦中老化病灶的形成，很可能是通過caspase-1和IL-1β介導而起作用[2]。本研究顯示，IL-1β在AD發病中起一定作用，但在VD的發病意義不大；而IL-18雖然是NLRP3炎癥小體的下游分子，但對AD或VD發病的意義均很有限。Halle等用Aβ處理小神經膠質細胞，加有溶酶體抑制劑細胞松弛素D或組織蛋白酶B抑制劑處理組中，IL-1β表達均減少，提示Aβ通過溶酶體破裂途徑激活NLRP3炎性小體誘導IL-1β表達，并促進AD進展[13]；有時Aβ能夠誘導大量IL-1β表達，促進AD發生和發展，在此過程中NLRP3起關鍵作用[14]。

在AD的發病機制中，鈣離子失衡也有較大作用。鈣離子在突觸的發育和重塑、神經存活等方面起重要作用，鈣離子過多進入細胞內將導致細胞內鈣超載，引起神經細胞死亡[15]。本研究顯示，如果單純分析患者血液WBC和血清總鈣濃度，并無異常情況；但AD患者NLRP3 mRNA與血清總鈣濃度呈正相關，與WBC無關；VD患者NLRP3 mRNA與這兩者均無相關性。提示NLRP3在AD發病中的作用可能與血液中鈣離子濃度的增高有一定關系。另外我們發現，AD患者NLRP3 mRNA表達與IL-1β呈正相關，而在VD患者中兩者無明顯相關，提示IL-1β在AD的發病中可能更重要，而與VD發病的關系有待進一步分析。

在AD病程進展中，關于鈣離子與IL-1β或NLRP3的相互作用可能是很復雜的網絡調控，確切的機理還不清楚。有學者認為，鈣離子與鈣敏感受體(calcium sensing receptor,CASR)結合，激活NLRP3炎性小體；活化的CASR一方面降低細胞內的cAMP濃度，以解除cAMP對NLRP3的抑制作用，另一方面還可以誘導內質網釋放鈣離子，使細胞內鈣離子水平持續升高，導致線粒體功能受損，并釋放mtDNA誘導NLRP3炎性小體活化[15-16]。

總之，NLRP3炎性體的作用有可能是Aβ代謝異常誘導AD發生發展的關鍵環節，針對這一環節深入研究有望對AD的治療產生新的突破。

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Expression of Nucleotide-binding Oligomerization Domain Receptor Protein 3 in Patients with Alzheimer's Disease and Vascular Dementia and Related Factors

BAI Hua1a,1b,YANG Bo1c,YU De-jun1a,ZHANG Qi-fang2
1.a.Medical Laboratory Center;b.Department of Neurology;c.Department of Psychiatry;the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Duyun,Guizhou 558000,China;2.Key laboratory of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 555000,China

Correspondence to BAI Hua and ZHANG Qi-fang.E-mail:baihcd@126.com(BAI Hua),gracezhang886@hotmail.com(ZHANG Qi-fang)

Abstract:Objective To explore the role of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3(NLRP3)inflammasome in the pathogenesis of dementia.Methods 16 patients with with Alzheimer's disease(AD),22 patients with vascular dementia(VD)and 20 healthy persons with similar age were detected the level of NLRP3 mRNA with RT-PCR in peripheral blood mononuclear cells January,2014 to October,2015.The serum level of interleukin(IL)-1β and IL-18 were detected with ELISA.The total number of white blood cells(WBC)and serum total calcium were collected.Single factor correlation analysis was performed between NLRP3mRNA and IL-1β,or IL-18,or WBC,or calcium concentration.Results The levels of NLRP3 mRNA ranged from high to low were as in AD group >VD group >the healthy group(q>11.48,P<0.05).The serum level of IL-1β was higher in AD group than in the the healthy group(q=16.74,P<0.05),but not significantly different between VD group and the healthy group,nor between VD group and AD group(P>0.05).There was no significant difference about IL-18 among AD group,VD group and the healthy group(P>0.05).NLRP3 mRNA was positively correlated with the serum levels of IL-1β(r=0.64)and calcium(r=0.58)in AD group.There was no correlation between NLRP3 mRNA and IL-18 or WBC(P>0.05).Conclusion The expression of NLRP3 inflammasome may be related with the pathogenesis of AD,but little impact on the pathogenesis of VD.

Key words:Alzheimer's disease;vascular dementia;nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3;inflammation;pathogenesis

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-01)

基金項目：1.國家自然科學基金項目(No.8156110223)；2.貴州省科技廳重大專項(No.黔科合計Z字2012-4010號)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.015

[中圖分類號]R749.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)03-0306-04

作者單位：1.貴州醫科大學第三附屬醫院，a.醫學實驗中心；b.神經內科；c.精神科，貴州都勻市558000；2.貴州醫科大學醫學分子生物學重點實驗室，貴州貴陽市555000。作者簡介：柏華(1964-)，男，漢族，湖南寧遠縣人，博士，教授，研究生導師，主要研究方向：老年性癡呆的發病機制和神經保護治療。通訊作者：張啟芳(1966-)，女，博士，教授。E-mail:baihcd@126.com(柏華),gracezhang886@hotmail.com(張啟芳)。