生殖道白色念珠菌耐吡咯類藥物的基因表達*1

羅妙玲，徐韞健，李倩珺

(1.海珠區第一人民醫院檢驗科，廣東廣州 510220；2.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 510120)

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·論著·

生殖道白色念珠菌耐吡咯類藥物的基因表達*1

羅妙玲1，徐韞健2△，李倩珺2

(1.海珠區第一人民醫院檢驗科，廣東廣州 510220；2.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 510120)

摘要:目的了解生殖道白色念珠菌耐吡咯類藥物基因的表達情況。方法收集真菌性陰道炎患者分泌物標本93份，分離白色念珠菌后用紙片擴散法進行藥敏試驗，裂解法提取白色念珠菌的吡咯類藥物耐藥株和敏感株的總RNA，逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測白色念珠菌多藥耐藥基因CDRl、CDR2、MDRl的表達情況。結果共培養出59株白色念珠菌，18株熱帶念珠菌，10株克柔念珠菌，6株光滑念珠菌；白念珠菌中37株對氟康唑、酮康唑、咪康唑不同程度耐藥，耐藥率分別為16.7%、18.3%、51.7%；白念珠菌耐藥株CDR1基因的2(-△△Ct)為1.46±0.24，敏感株為1.09±0.27，兩組比較，差異有統計學意義(t=-4.22，P=0.001)；CDR2及MDRl基因的表達差異均無統計學意義(P=0.170，P=0.800)。結論白色念珠菌耐藥機制較為復雜，可能與CDR1高表達有關，CDR2和MDR1表達與耐藥性的關系有待進一步研究。

關鍵詞:生殖道；白色念珠菌；基因表達；吡咯類藥物

外陰陰道念珠菌病(VVC)是一種由念珠菌引起的陰道黏膜真菌性感染，近年來發病率有明顯上升的趨勢[1]。由于吡咯類藥物，如酮康唑、氟康唑、咪康唑等具有抗菌譜廣、不良反應少等優點，已成為臨床治療真菌感染的首選藥物，然而，近年來吡咯類藥物的大量應用導致耐藥性越來越嚴重。念珠菌的耐藥機制主要有麥角甾醇合成通路中關鍵靶酶的變化造成膜成分的改變，生物被膜的形成，編碼藥物外排泵的基因表達增加，細胞膜對藥物通透性改變等[2]。其中外排基因CDR1、CDR2、MDR1過度表達是產生耐藥的主要原因。因此，本文就門診患者陰道分泌物中分離的白色念珠菌對吡咯類藥物相關耐藥基因的表達進行研究，從分子水平了解耐藥機制，以期為臨床治療提供參考依據。

1資料與方法

1.1一般資料2015年1～2月廣州市海珠區第一人民醫院與廣州醫科大學附屬第一醫院婦科門診就診的真菌性陰道炎患者93例，年齡20～45歲，均有典型的豆腐渣樣白帶和外陰瘙癢等癥狀，留取陰道分泌物標本，直接革蘭染色鏡檢發現菌絲或孢子。

1.2儀器與試劑Total RNA 提取試劑、PCR 檢測試劑及DNA 標記物均購自大連寶生物工程有限公司；金星 TaqMan預混體系試劑購自上海生工生物技術有限公司；沙氏培養基和真菌藥敏培養基購自法國梅里埃生物公司；氟康唑(15 μg)、酮康唑(15 μg)和咪康唑(10 μg)藥敏紙片購自丹麥Rosco公司；Vitek-2 Compact細菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；CFX 96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3引物及探針設計參考GenBank設計CDR1、CDR2、MDR1和內參基因的引物，由上海生工生物技術有限公司合成，引物及探針序列見表1。

表1　　引物及探針序列

1.4方法

1.4.1真菌培養和藥敏試驗將分泌物轉接到沙氏瓊脂培養基平板上培養72 h，有菌落生長者涂片做革蘭染色，鏡下觀察為念珠菌者，接種至科馬嘉念珠菌顯色培養基上，48 h后觀察顏色，判別菌種，無法鑒定者通過Vitek-2 Compact細菌鑒定儀鑒定。對菌株進行紙片擴散(K-B)法藥敏試驗，置于溫箱37 ℃培養24 h后測量抑菌圈，依據表2標準判斷藥敏情況。

表2　　吡咯類藥物抑菌環直徑的判斷標準(mm)

1.4.2總RNA的抽提液氮裂解白色念珠菌的細胞壁，用氯仿和異丙醇提取總RNA，用超微量紫外分光光度計測定總RNA樣品純度及濃度。

1.4.3逆轉錄和實時熒光定量PCR擴增逆轉錄體系：PrimeScript RT標記混合液2 μL，總RNA(根據濃度確定加入量，10 μL體系最大使用500 ng)，RNase Free dH2O加至10 μL；反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實時熒光定量PCR擴增體系：PCR mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase Free dH2O 10 μL，探針0.5 μL，cDNA 1 μL。發光基團為5′-FAM，淬滅基團為TAMRA。擴增程序：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個循環。計算方法如下：目的基因相對表達量=2-△△Ct,△△Ct=目的基因的Ct值-內參基因的Ct值。

2結果

2.1培養及鑒定結果93例女性的陰道分泌物均培養出念珠菌，其中59株為白色念珠菌，占63.4%，18株為熱帶念珠菌，10株為克柔念珠菌，6株為光滑念珠菌。

2.2吡咯類藥敏試驗結果59株白色念珠菌菌株經過藥敏試驗后，其中37株對咪康唑、酮康唑、氟康唑中一種或以上藥物耐藥，耐藥率分別為51.7%、18.3%、16.7%，37株納入耐藥組。從敏感株中選取10株納入敏感組。

2.3CDR1、CDR2及MDR1的表達水平實時熒光定量PCR檢測到各基因的Ct值，經計算，耐藥組CDR1基因2-△△Ct值明顯高于敏感株組，差異有統計學意義(P=0.001)；而CDR2和MDR1基因2-△△Ct值在耐藥組與敏感組中的差異均無統計學意義(P=0.170,P=0.800)，見表3。

表3　　耐藥組和敏感組基因2-△△Ct比較±s)

3討論

白色念珠菌對吡咯類藥物耐藥主要有以下三條途徑：藥物作用靶位的變化；外排泵基因如CDR1、CDR2、MDR1的過度表達，細胞對藥物的主動外排，減少了唑類抗真菌藥物在胞體內的累積；細胞膜對藥物通透性改變，使細胞攝取和積聚藥物的量降低[3-4]。其中，白色念珠菌的藥物外排能力增強導致胞內藥物濃度降低是主要的耐藥機制。目前已知與吡咯類藥物外排有關的跨膜轉運蛋白有兩類：一類是含ATP結合轉運蛋白，是ATP能量依賴型多藥轉運載體，是細胞膜上的外排機能泵，其與耐藥有關的主要有CDR1和CDR2基因編碼的Cdr1p蛋白和Cdr2p蛋白；另一類是主要易化載體超家族蛋白，是非能量依賴型載體，其與耐藥有關的主要是由MDR1基因編碼的Mdr1p蛋白。相關文獻報道Cdr1p、Cdr2p蛋白以降低細胞內藥物濃度的方式來增加藥物的外排[5]，而Mdr1p蛋白則通過抑制藥物攝入來實現。

熒光定量PCR是一種準確、有效的核酸定量分析技術，相對定量主要應用于mRNA表達量解析，先測定目的基因的相對表達量，再進行樣品間相對量的比較。本研究通過采用相對定量TaqMan探針法，引入內參基因，將目的基因表達量進行歸一化處理，以消除初始RNA的差異帶來的表達差異。本研究結果顯示耐藥組與敏感組CDR1基因在mRNA表達水平上存在差異，表明耐藥組CDR1基因的高表達可能與耐藥形成有關。相關文獻報道白色念珠菌耐藥多以CDR1或CDR2表達上調為主[6-7]。CDR1和CDR2基因所編碼的轉運蛋白在氨基酸序列上有高度同源性，所轉運的底物相似，結合本課題組前期的結果[8-9]，本研究認為CDR1外排能力更強，在耐藥形成中發揮作用更大。但CDR2和MDR1表達差異無統計學意義(P>0.05)，不能證明其與耐藥無關，跨膜轉運蛋白外排泵的兩種類型編碼基因的調節是相互獨立的，在大多數吡咯類藥物耐藥株中僅過表達其中一種外排泵；白色念珠菌耐藥性的形成是通過多因素的調節，體內長期演變實現的，基因表達增加只是引起耐藥的原因之一。

抗真菌藥物的濫用導致吡咯類藥物產生不同程度的耐藥，應從分子水平、生物膜形成等方面進一步探究藥物作用靶位，或探索更好的聯合用藥方案，如李豐霞等[10]發現漢防己甲素對氟康唑抗菌活性有增強作用，Zhu等[11]發現氟康唑和小檗堿聯合用藥可通過阻斷CDR1轉錄因子結合藥物作用元件達到抗菌作用。主動外排泵蛋白基因過度表達在多藥耐藥產生中的作用已逐漸被重視，本文對生殖道白色念珠菌耐藥分子機制的研究有助于發現新的作用靶位點和研制泵抑制性抗真菌藥物。

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Expression of pyrrole drugs resistance genes in Candida albicans from genital tract*1

LuoMiaoling1,XuYunjian2△,LiQianjun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HaizhuDistrictFirstPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510220,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of resistance genes in pyrrole resistant Candida albicans from genital tract.MethodsThe Candida albicans were isolated from the vaginal secretions of 93 vaginitis patients,and Kirby-Bauer method was performed for preliminary culture of strains resistant.The total RNA was extracted from pyrrole-resistant and susceptible Candida albicans isolated by pyrolysis method and cDNA was synthesized.The expression of CDR1,CDR2,MDR1 genes was then detected by Real-time quantitative PCR.ResultsA total of 59 strains of Candida albicans,18 strains of Candida tropicalis,10 strains of Candida krusei and 6 strains of Candida glabrata were cultured.37 strains of Candida albicans were resistant to fluconazole,ketoconazole,and miconazole at different degrees,and the drug resistance rates were 16.7%，18.3%，51.7%;CDR1 gene′s 2(-△△Ct) in sensitive strains group was 1.09±0.27,while resistant strains group was 1.46±0.24,there was significant difference between two groups (t=-4.22,P=0.001).There was no significant difference in the expression of CDR2 and MDR1 genes between the sensitive and resistant strains(P=0.170，P=0.800).ConclusionThe drug resistance of Candida albicans mechanism is complicated,it might be associated with high CDR1 expression,the relationship between CDR2,MDR1 expression and multidrug resistance needs further study.

Key words:genital tract；Candida albicans;genes expression；pyrrole drugs

(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0721-03

基金項目：廣東省臨床重點專科建設項目(2013)。

作者簡介：羅妙玲，女，主管技師，主要從事臨床檢驗技術研究。(△)通訊作者，E-mail:vinkent@126.com。