2種方法檢測熱毒寧與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌協同作用的比較*1

李　新，楊桂芳，陳化禹，耿　潔，賈志杰

(天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193)

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·論著·

2種方法檢測熱毒寧與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌協同作用的比較*1

李新，楊桂芳，陳化禹，耿潔，賈志杰

(天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193)

摘要:目的觀察微量肉湯棋盤稀釋法與紙片擴散法檢測體外環境下中藥熱毒寧聯合頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(SCF)對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(XDR-AB)協同作用的結果，比較兩者的符合性，以指導臨床用藥。方法篩選2015年該院住院患者感染的XDR-AB共12 株，將菌株培養傳代，先采用微量肉湯棋盤稀釋法檢測SCF和熱毒寧單獨及聯合使用時的最低抑菌濃度(MIC),通過計算判斷是否有協同作用,再使用紙片擴散法檢測抑菌環直徑和藥物的協同作用。結果微量肉湯棋盤稀釋法檢測熱毒寧與SCF聯合用藥時，與單獨用藥時相比，MIC均有不同程度下降，熱毒寧與SCF聯合用藥時的抑菌濃度指數均小于或等于0.5,具有協同作用。紙片擴散法測定出熱毒寧原液的抑菌環直徑為10 mm，不同XDR-AB菌株對SCF的抑菌環直徑有所差異，其中5株為15 mm，3株為16 mm，4株為17 mm。但當熱毒寧與SCF聯合作用時，抑菌環直徑擴大，12株也都出現了協同作用。結論體外環境下，熱毒寧聯合SCF對XDR-AB有很好的協同作用,2種方法結果一致，雖然紙片法更加簡便,但結果判斷帶有一定主觀性,需要有經驗的人員操作。

關鍵詞:廣泛耐藥鮑曼不動桿菌；熱毒寧；頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉；微量肉湯棋盤稀釋法；紙片擴散法

鮑曼不動桿菌已經成為我國院內感染最重要的病原菌之一[1]，常引起呼吸道感染、泌尿系統感染、敗血癥、繼發性腦膜炎等。近年來，隨著廣譜抗菌藥物在臨床的廣泛應用，鮑曼不動桿菌的耐藥性不斷增加，出現了廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(XDR-AB)，其對常用抗菌藥物幾乎全部耐藥，僅對多黏菌素和替加環素敏感[2]，給臨床治療帶來了很大挑戰，開發新的治療方案和新型藥物迫在眉睫。本研究觀察了熱毒寧與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(SCF)聯合使用對XDR-AB的體外抑菌作用，并對兩種方法進行了比較,旨在更好地為臨床治療提供依據。

1材料與方法

1.1材料12株XDR-AB分離自2015年1～6月本院住院患者，其中10株來源于痰液標本，2株來源于尿液標本。根據《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》選用法國梅里埃公司Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統及配套的分析卡進行菌種鑒定和藥敏試驗。藥敏結果按2012 年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)標準判斷。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。SCF由美國輝瑞公司提供，商品名為舒普深注射針劑，熱毒寧注射液由江蘇康緣藥業提供，藥敏紙片為輝瑞公司提供的SCF(75/30 μg)紙片。

1.2方法

1.2.1SCF對XDR-AB的最小抑菌濃度(MIC)將XDR-AB菌株培養傳代，分離單個菌落，用比濁儀配制細菌懸液1×108CFU/mL，再用水解酪蛋白(M-H)肉湯以1∶100稀釋(含菌量約106)備用。用M-H肉湯將SCF原液倍比稀釋成濃度為256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL的藥液，分別取各濃度藥液50 μL，依次由低濃度到高濃度加到96孔板中并做好標記。取備用菌液50 μL分別加入已加藥的孔中，使最終接種菌量約5×105CFU每孔。另設無菌對照孔(孔內只加M-H肉湯100 μL)和無藥對照孔(孔內只加M-H肉湯和菌液各50 μL)，振蕩1 min混勻后，35 ℃恒溫培養箱孵育20 h，肉眼觀察結果，記錄MIC[3]。

1.2.2熱毒寧對XDR-AB的MIC配備終濃度為原液的1.00、0.80、0.64、0.51、0.41、0.33、0.26、0.21、0.17倍的熱毒寧，分別取各濃度藥液50 μL，依次由低濃度到高濃度加到96孔板中并做好標記。分別取備用菌液50 μL加入已加藥的孔中。另設無菌對照孔(孔內只加M-H肉湯100 μL)和無藥對照孔(孔內只加M-H肉湯和菌液各50 μL)，振蕩1 min混勻后，35 ℃恒溫培養箱孵育20 h，肉眼觀察結果，記錄MIC。

1.2.3微量肉湯棋盤稀釋法測定熱毒寧聯合SCF對XDR-AB的抑菌作用稱量并配制2倍MIC的藥物，將SCF倍比稀釋成8個濃度，方法同1.2.1,熱毒寧配制濃度方法同1.2.2。在96孔板上做好標記，SCF從上到下依次遞減，熱毒寧從左到右濃度依次遞減，另設無菌對照孔和無藥對照孔。在96孔板中，每個對應孔加兩種藥液各50 μL和菌液100 μL后，振蕩1 min混勻，35 ℃孵育20 h，觀察抑菌濃度指數(FICI)。

1.2.4紙片擴散法檢測熱毒寧及SCF單獨的抑菌環直徑將經培養基傳代后的細菌配制成相當于0.5麥氏比濁管濃度的菌懸液，用無菌棉簽取配制好的細菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂培養基表面，放置10 min待平板表面菌液吸收，用直徑7 mm的無菌打孔器在每個涂菌的固體培養基上垂直均勻打2個孔，分別加入熱毒寧原液和注射用水各200 μL。在距熱毒寧孔2 cm以外貼SCF紙片，35 ℃培養20 h。用游標卡尺測量每個抑菌環的直徑，抑菌環邊緣以肉眼看不到細菌明顯生長為限[3]。中藥抑菌圈直徑：<8 mm為不敏感(-)，8～<13 mm為低度敏感(+)，13～<19 mm為中度敏感(++)，≥19 mm為高度敏感(+++)。SCF抑菌環直徑：≤15 mm為耐藥，16～20 mm為中介，≥21 mm為敏感。

1.2.5紙片擴散法測定聯合抑菌作用同樣的方法檢測SCF和熱毒寧的聯合作用。檢測兩者協同作用時，最好控制在大于兩藥抑菌環半徑之和2 mm結果較理想,以兩種藥物之間的敏感區域增加為有協同現象。

1.3統計學處理采用Excel2007軟件進行數據處理及統計學分析。

2結果

2.1熱毒寧與SCF單獨用藥時MIC及兩者聯合時FICI熱毒寧與SCF聯合用藥時的FICI均小于或等于0.5，說明兩者有協同作用。見表1。

表1　　熱毒寧與SCF單獨用藥時MIC及兩者聯合用藥時FICI

2.2熱毒寧與SCF的協同作用經紙片擴散法測定出熱毒寧原液的抑菌環直徑為10 mm，不同XDR-AB菌株對SCF的抑菌環直徑有所差異，其中5株為15 mm，3株為16 mm，4株為17 mm。當熱毒寧與SCF聯合使用時，出現了協同作用。見圖1。

箭頭1：陰性對照；箭頭2～3：熱毒寧與SCF的協同作用。

圖1熱毒寧與SCF的協同作用

3討論

鮑曼不動桿菌耐藥現象十分嚴重，對氨基糖苷類、氟喹諾酮類及β-內酰胺類等抗菌藥物均產生了一定的耐藥性，具有多重耐藥基因[4]，給臨床治療造成了極大困難。本研究用微量肉湯棋盤稀釋法及紙片擴散法探討了中藥熱毒寧與SCF對XDR-AB的聯合作用。本研究觀察到熱毒寧對XDR-AB抑菌環為10 mm,有輕度抑菌作用，如果臨床單獨用熱毒寧治療XDR-AB感染可能不易取得滿意結果。聯合熱毒寧后，菌株對SCF的敏感性明顯提高。夏美玲等[5]將黃芩、金銀花與阿奇霉素聯用，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比單用阿奇霉素明顯增強。馬東梅等[6]發現雙黃連對XDR-AB有抑制作用，其認為中藥聯合抗菌藥物應用可降低抗菌藥物使用量。SCF對XDR-AB的MIC明顯下降，下降濃度最高可達1/64 MIC。不同XDR-AB菌株對SCF的抑菌環直徑有所差異，其中5株為15 mm，3株為16 mm，4株為17 mm，這3組XDR-AB的MIC分別為128、64、32 μg/mL。不同菌株對SCF的敏感性不同。與熱毒寧聯合使用后，MIC為128 μg/mL的一組，SCF和熱毒寧的MIC下降幅度最大。可見中藥熱毒寧與SCF對XDR-AB有很好的協同作用。

紙片擴散法是根據抑菌環直徑和抗菌藥物MIC的負相關性質設定的定性試驗，由于該方法簡便可靠，實用性強，仍是目前常規實驗室普遍采用的定性試驗，本研究在判斷產超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)的紙片協同法的基礎上[3]，參照管仲瑩等[7]的金銀花抑菌作用研究，嘗試用SCF紙片擴散聯合熱毒寧打孔的方法觀察協同作用。SCF選用濃度為75/30 μg SCF作為藥敏紙片，熱毒寧使用原液。雙紙片協同試驗影響因素較多,掌握好兩藥之間的距離很關鍵,經過多次摸索，最好控制在大于兩藥抑菌環半徑之和2 mm，與微量肉湯棋盤稀釋MIC法比對，結果一致。但在操作過程中應注意設置對照,選擇最佳的紙片間距。

微量肉湯棋盤稀釋法聯用兩種藥物，以二維棋盤縱橫兩個方向分別進行倍比稀釋。藥物相互作用效應通過計算最小部分FICI來判斷。FICI=(聯合用藥時SCF的MIC/單獨用藥時SCF的MIC)+(聯合用藥時熱毒寧的MIC/單用時熱毒寧的MIC)。FICI≤0.5為協同作用，0.52.0為拮抗作用[8]。在采用MIC微量肉湯棋盤稀釋法檢測熱毒寧聯合SCF作用XDR-AB時，以無菌對照孔作為敏感的標準，以無藥對照孔作為耐藥的標準，分別記下兩藥單獨和聯合的MIC，再計算FICI。但由于熱毒寧本身為棕褐色，敏感和耐藥結果不是特別清晰，且操作繁瑣，需要稀釋不同濃度的SCF和熱毒寧。熱毒寧與SCF聯合用藥時的FICI均小于或等于0.5，說明兩者有協同作用，與紙片擴散法得到的結果一致。

綜上所述，微量肉湯棋盤稀釋法可以檢測到MIC，可以量化觀察兩種藥物對XDR-AB的聯合作用，但很繁瑣。而紙片擴散法簡單易行，也可以直觀地反映出兩種藥物的聯合作用，結果判斷帶有主觀性,需要有經驗的人員操作。隨著廣泛耐藥菌的出現，中西醫結合治療也是很好的治療方案，筆者下一步將深入到分子生物學繼續研究中西藥聯合應用的抗菌機制。

參考文獻

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Comparison of two methods testing synergistic action of Reduning and cefoperazone sodium/sulbactam sodium on extensive drug resistant Acinetobacter bauman*1

LiXin,YangGuifang,ChenHuayu,GengJie,JiaZhijie

(TheFirstAffiliatedHospitalofChineseTraditionalMedicalUniversityofTianjin,Tianjin300193,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the results of broth dilution method and disc diffusion method to test the synergistic effect of Reduning and cefoperazone sodium / sulbactam sodium(SCF) on extensive drug resistant Acinetobacter bauman (XDR-AB) in vitro environment,and compare their compliance to guide the clinical medication.MethodsA total of 12 strains of XDR-AB from infection patients in our hospital in 2015 were collected,the strain was sub cultured.Firstly,observe the minimum inhibitory concentration (MIC) of SCF and Reduning on XDR-AB alone and in combination by broth dilution method.And then judge the synergy effects through calculation.Secondly,the inhibition ring diameter and the synergy effects was detected using the disc diffusion method.ResultsThe MIC of Reduning and SCF in combination on XDR-AB was declined compared with them alone.The Fractional inhibitory concentration of Reduning and SCF in combination on XDR-AB were equal or less than 0.5,they had synergistic effect on XDR-AB.The inhibition ring diameter of Reduning was 10 mm tested by disk diffusion method.Different strains of XDR-AB on SCF bacteriostatic annulus diameter difference,5 strains were 15 mm,3 strains were 16 mm,and 4 strains were 17 mm.Reduning and SCF appeared synergistic effect according to the inhibition ring diameter expanded when they effected on XDR-AB in combination.ConclusionIn vitro,Reduning combined with SCF on XDR-AB has good synergistic effect.Compared with broth microdilution checkerboard dilution method,disk diffusion method is more simple and convenient,but it has a certain subjective on judging results,which is better to operate by experienced person.

Key words:extensive drug resistant Acinetobacter bauman;Reduning;cefoperazone sodium/sulbactam sodium;broth microdilution checkerboard dilution method;disc diffusion method

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.002

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0723-03

基金項目：天津市中醫藥管理局中醫中西醫結合科研課題項目(13065)。

作者簡介：李新，女，副主任技師，主要從事臨床微生物研究。