抑制性差減雜交技術分離白血病多藥耐藥基因

王　楠，潘　喆，袁　宏

(大連醫科大學附屬第一醫院：1.檢驗科；2.病理科，遼寧大連 116023)

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·論著·

抑制性差減雜交技術分離白血病多藥耐藥基因

王楠1，潘喆2△，袁宏1

(大連醫科大學附屬第一醫院：1.檢驗科；2.病理科，遼寧大連 116023)

摘要:目的分離及鑒定與白血病多藥耐藥性相關的差異表達基因。方法采用抑制性差減雜交(SSH)技術分離非耐藥細胞株K562與耐藥細胞株K562/DOX差異表達基因。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，經限制性內切酶RsaⅠ酶切后，分別與不同的接頭(adopter1和adopter2R)連接；連接產物插入pMD19-T載體后轉入大腸埃希菌中，構建cDNA差減文庫；挑取陽性克隆提取質粒進行測序及同源序列分析，確定差異表達基因。結果篩選獲得220個差異表達基因，包括血紅蛋白、核糖體和線粒體等相關基因，以及熱休克因子結合蛋白(HSPB1)基因等其他基因。結論采用SSH技術及分子克隆技術可構建耐藥及非耐藥腫瘤細胞株差異表達基因的差減cDNA文庫，能夠為進一步篩選、克隆腫瘤細胞多藥耐藥性相關差異表達基因奠定基礎。

關鍵詞:白血病；多藥耐藥；抑制性差減雜交；差異表達基因

白血病細胞多藥耐藥是導致化療效果減低或治療無效的主要原因，而耐藥基因過度表達是腫瘤細胞形成耐藥性的基礎。研究白血病耐藥細胞基因表達的差異，可獲知細胞出現表型差異的原因，提供復雜生命過程的基本信息[1]。本研究采用抑制性差減雜交(SSH)技術構建非耐藥白血病細胞株K562與耐藥細胞株K562/DOX差異表達基因的cDNA文庫[2]，為篩選白血病耐藥基因，揭示白血病多藥耐藥的形成機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1細胞株白血病細胞株K562由大連醫科大學血液檢驗研究所惠贈，耐藥細胞株K562/DOX購自天津血液病研究所。所有細胞均按常規方法培養于含10%小牛血清的RPMI1640培養基中，5%CO2、37 ℃培養箱中傳代培養，1～2 d換液1次使細胞維持對數生長。K562/DOX細胞株定期采用阿霉素沖擊以維持其耐藥性(阿霉素應用劑量為10 μg/mL，1小時/次，1次/周)。停藥2周后進行后續實驗。

1.2試劑SMARTer cDNA合成試劑盒(SMARTer cDNA Synthesis Kit，批號：634925)、SSH試劑盒(PCR-Select cDNA Subtraction試劑盒，批號：637401)、DNA片段純化試劑盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，批號：DV807)、DNA連接試劑盒(DNA Ligation Kit，批號：D6020A)、pMD19-T載體(pMD19-T Vector，批號：D102A)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3方法

1.3.1cDNA合成及確認最佳PCR產物以2 μL細胞總RNA作為模板，逆轉錄合成cDNA，PCR反應條件：72 ℃ 3 min，42 ℃ 2 min。為獲得較高濃度產物和確認最佳PCR產物，進行一系列PCR擴增，以電泳結果確認最佳產物。PCR反應條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，循環次數分別為15、18、21、24、27次。采用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，根據電泳結果確認最佳循環次數。對PCR產物進行純化處理，電泳確認純化效果。

1.3.2cDNA酶切及確認采用限制性內切酶RsaⅠ對K562細胞及K562/DOX細胞cDNA進行酶切，反應體系為最佳產物cDNA 300 μL，10×RsaⅠ酶切緩沖液36 μL，RsaⅠ 1.5 μL，反應條件為37 ℃ 3 h。采用1%瓊脂糖凝膠對10 μL未酶切的cDNA和10 μL RsaⅠ酶切后的cDNA進行電泳，同時加入8 μL 乙二胺四乙酸/糖原混合物終止反應，2%瓊脂糖凝膠電泳確認產物。

1.3.3連接反應以人骨骼肌細胞DNA作為對照組(Control組)，將2 μL DNA加入38 μL dH2O中，DNA終濃度為150 ng/mL。以K562/DOX細胞DNA作為檢測組(Tester組)，取RsaⅠ酶切后的cDNA產物進行5倍稀釋。根據接頭(adaptor)的差異分為4個亞組，分別為K562/DOX Tester1-1組、K562/DOX Tester1-2組、Control Tester1-1組和Control Tester1-2組。為檢測連接是否正常，加入1 μL 20 乙二胺四乙酸/糖原混合物終止反應，72 ℃預熱5 min，反應體系為cDNA 2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，adaptor1/adaptor2R 2 μL；反應條件為94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，共25個循環，電泳確認反應結果。

1.3.4差減雜交反應將RsaⅠ酶切處理的cDNA分別與連接產物進行第1輪雜交；反應條件：98 ℃ 90 s，68 ℃ 8 h。將第1輪雜交產物混合進行第2輪雜交；反應條件：98 ℃ 90 s，68 ℃過夜。

1.3.5PCR擴增反應第1次PCR擴增反應體系為雜交產物/未雜交產物/Control雜交產物/陰性對照品各1 μL，10×含Mg2+的AdvantageTMPCR緩沖液2.5 μL，50×dNTP混合物(每種dNTP濃度為10 mmol/L)0.5 μL，50×AdvantageTM聚合酶混合液(2.5 U/μL)0.5 μL，PCR引物1(10 μmol/L)1 μL；反應條件：75 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共27個循環，電泳確認PCR產物。為富集PCR產物，取1 μL稀釋后的第1次PCR反應產物進行第2次PCR反應。

1.3.6陽性克隆篩選與確認采用DNA片段純化試劑盒精制第2次PCR反應產物，命名為CTD809 PCR，使用DNA連接試劑盒對CTD809 PCR與pMD19-T 載體進行連接；連接產物經熱轉化大腸埃希菌后涂布平板，37 ℃培養過夜；挑選單克隆菌落篩選陽性克隆；提取陽性克隆菌落質粒，由寶生物工程(大連)有限公司進行測序；采用Gene Bank數據庫對測序結果進行比對分析，確認差減雜交文庫是否構建成功。

2結果

2.1cDNA合成及確認最佳PCR產物對循環次數分別為15、18、21、24、27次的反應產物各5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳(見圖1)，確認最佳循環次數為15次。

M：1 Kb DNA Ladder分子標記物；1～5：K562細胞cDNA合成產物；6～10：K562/DOX細胞cDNA合成產物；11～15：小鼠cDNA合成產物。

圖1PCR反應產物電泳結果

2.2cDNA酶切及確認采用限制性內切酶RsaⅠ對cDNA產物進行酶切，產生末端平頭的片段。將未酶切和酶切的產物各10 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)。

M：1 Kb DNA Ladder分子標記物；1：K562細胞cDNA未酶切產物；2：K562細胞cDNA RsaⅠ酶切產物；3：K562/DOX細胞cDNA未酶切產物；4：K562/DOX細胞cDNA RsaⅠ酶切產物；5：小鼠cDNA未酶切產物；6：小鼠cDNA RsaⅠ酶切產物。

圖2RsaⅠ酶切產物電泳結果

M3：ФX174 HaeⅢ酶切產物；1：Tester1-1 PCR產物(小鼠)；2：G3PDH 3′Primer PCR產物(小鼠)；3：Tester1-2 PCR產物(小鼠)；4：G3PDH 5′Primer PCR產物(小鼠)；M：DL2000 DNA分子標記物。

圖3連接反應PCR產物電泳結果

M3：ФX174 HaeⅢ酶切產物；5：Tester1-1 PCR產物(K562/DOX細胞)；6：G3PDH 3′Primer PCR產物(K562/DOX細胞)；7：Tester1-2 PCR產物(K562/DOX細胞)；8：G3PDH 5′Primer PCR產物(K562/DOX細胞)；M：DL2000 DNA分子標記物。

圖4檢測反應PCR產物電泳結果

2.3連接反應Control組和檢測組標本分別連接不同的cDNA adaptor(即adaptor1和adaptor2R)。adaptor的末端無磷酸基團，僅有adaptor的1條鏈與cDNA 5′末端相連，adaptor1和adaptor2R具有不同的序列，因此當殘留末端被補平后，可同時與2個不同的PCR引物進行退火連接反應。為檢測連接效率，將產物各5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳(見圖3、4)。電泳結果表明連接效率大于25%，符合后續實驗要求。

2.4PCR擴增在第1次PCR擴增中，兩端連接有不同adaptor的差異表達序列能夠進行指數擴增，僅有一端連接adaptor或兩端連接同一adaptor形成發卡結構時，只能進行線性擴增，沒有引物結合位點則不能進行擴增。第1次PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果(見圖5)顯示，Control組與Tester組雜交PCR產物大小分別為720、900 bp。第1次PCR擴增產物豐度低，為了富集產物進行第2次PCR擴增產物，擴增產物電泳結果(見圖6)顯示產物豐度明顯增加，陽性對照擴增產物條帶明顯，陰性對照無擴增產物。

M：ФX174 HaeⅢ酶切產物；1：Control組PCR產物(雜交)；2：Control組PCR產物(未雜交)；3：Control組PCR產物(陽性對照)；4：Control組PCR產物(陰性對照)；5：Tester組PCR產物(雜交)；6：Tester組PCR產物(未雜交)；7：Tester組PCR產物(陽性對照)；8：Tester組PCR產物(陰性對照)。

圖5第1次PCR產物電泳結果

M：ФX174 HaeⅢ酶切產物；1：Control組PCR產物(雜交)；2：Control組PCR產物(未雜交)；3：Control組PCR產物(陽性對照)；4：Control組PCR產物(陰性對照)；5：Tester組PCR產物(雜交)；6：Tester組PCR產物(未雜交)；7：Tester組PCR產物(陽性對照)；8：Tester組PCR產物(陰性對照)。

圖6第2次PCR產物電泳結果

2.5陽性克隆篩選及確認挑選24個單克隆菌落進行陽性克隆篩選，質粒測序結果顯示，在15個具有插入片段的陽性克隆中共有220個差異基因。經Gene Bank數據庫比對分析，選出覆蓋率90%和相似度98%以上的差異基因122個，舍去98個覆蓋率和相似度較小的差異基因。在選出的122個差異基因中，包括34個線粒體相關基因、10個甘油三磷酸脫氫酶基因、4個核糖體基因、3個支原體基因、7個血紅蛋白(HBE1)基因、1個凝血因子Ⅷ基因、1個熱休克因子結合蛋白1(HSBP1)基因和62個未知基因。

3討論

腫瘤細胞耐藥基因的存在不但影響化療效果，也影響患者預后。耐藥基因的表達是腫瘤細胞產生多藥耐藥性的分子基礎。因此，鑒定耐藥細胞和非耐藥細胞間的差異基因是闡明耐藥性發生機制的重要手段。本研究選用遺傳背景相同的非耐藥K562細胞與K562/DOX耐藥細胞，經SSH篩選得到相關差異基因，部分差異基因具有生物學功能，在腫瘤細胞產生耐藥性方面具有更大的作用。

較高濃度水平的cDNA是順利完成SSH實驗的必備條件，而本研究中的限制性酶切產物電泳結果顯示，逆轉錄合成的K562/DOX和K562細胞cDNA水平無法滿足SSH實驗的要求。因此，本研究采用PCR擴增富集的方法使cDNA水平達到300 ng/μL。此外，本研究將cDNA合成條件分別設定為15、18、21、24、27次循環，合成產物電泳結果顯示15次循環得到的cDNA產物濃度水平最高，為最佳循環次數。而在選擇陽性對照時，最初選擇了可應用于SSH實驗的小鼠總RNA，但PCRC產物電泳圖顯示實驗結果不理想，推測原因可能是受到種系同源性因素的影響。因此，本研究選用人骨骼肌細胞cDNA作為陽性對照。

在應用SSH技術后，本研究選擇24個單克隆菌落進行質粒測序，在15個有插入片段的陽性克隆中共獲得220個差異基因。經Gene Bank比對分析，選出覆蓋率為90%和相似度為98%以上差異基因122個，其中線粒體相關基因共34個，包括22個線粒體基因、11個人類離子細胞內通道蛋白(CLIC2)基因、1個電位依賴性離子通道3(VDAC3)基因。線粒體基因在多藥耐藥腫瘤細胞和非耐藥腫瘤細胞間呈明顯的差異表達，提示線粒體基因的表達可能與腫瘤細胞產生多藥耐藥性密切相關。

電位依賴性離子通道(VDAC)也稱線粒體穿孔蛋白，在線粒體外膜中表達水平較高，VDAC3是VDAC的3種異構體之一。線粒體可感受細胞能量代謝水平的變化，進而影響核基因的表達[3]。有研究證實，離子通道尤其是VDAC參與了腫瘤細胞的演化，在調節細胞周期方面具有重要作用[4]。因此，VDAC是近年來外源化學物所致細胞凋亡機制研究領域的熱點之一。VDAC基因表達水平增高或降低均影響線粒體功能，與細胞生存及凋亡密切相關[5]。腫瘤細胞膜上也分布著不同類型的離子通道，并與腫瘤的發生、發展密切相關，其中VDAC基因的表達與腫瘤的形成有關，但與白血病細胞多藥耐藥性的相關性研究未見報道。本研究證實VDAC3基因可能在白血病細胞產生多藥耐藥性方面具有一定的作用，但具體作用機制有待進一步研究證實。

核糖體蛋白S4-X基因亦為耐藥與非耐藥白血病細胞差異基因之一。核糖體參與基因的復制、轉錄，具有調控機體發育等功能，與正常細胞的惡性轉化及腫瘤細胞產生耐藥性密切相關。本研究也篩選出具有差異表達的3個支原體基因，分別是支原體基因JER、M64、PG18。支原體基因的高表達可能引起腫瘤細胞生物學行為的改變，提示支原體基因的異常表達與腫瘤的發生有潛在的相關性。

此外，10個甘油三磷酸脫氫酶基因、1個凝血因子Ⅷ基因、7個HBE1基因、1個HSBP1基因和62個未知基因也是差異表達基因，可能在白血病細胞產生耐藥性方面具有一定的作用。HSBP1可結合熱休克蛋白70(HSP70)基因啟動子，減弱或阻止HSP70基因的轉錄。HSBP1是線粒體的“分子伴侶”之一，但與白血病細胞多藥耐藥性的相關性研究未見報道。本研究結果顯示，HSBP1基因與VDAC3基因都可能參與了白血病多藥耐藥的形成，具體作用機制有待進一步研究證實。筆者推測，HSBP1基因的差異表達可能是調控VDAC基因參與腫瘤細胞產生耐藥性的關鍵因素。VDAC3基因啟動子區可能含有熱休克元件(HSE)，HSBP1通過與HSE的結合調控VDAC基因的表達([6-7])。

綜上所述，本研究采用SSH技術成功構建了K562/DOX細胞與K562細胞的差異表達基因，且多數差異表達基因為線粒體相關基因，提示線粒體基因的表達在白血病細胞產生耐藥性方面具有關鍵作用。本研究也篩選出一些罕見報道的基因，如HSBP1基因。這些具有調控作用的基因在白血病細胞產生耐藥性中的作用更應值得注意，其與線粒體相關基因的關系值得深入研究和分析。

參考文獻

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Multidrug resistance associated genes of leukemia separated by suppression subtractive hybridization

WangNan1，PanZhe2△，YuanHong1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory；2.DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian，Liaoning116023，China)

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify differential expression genes associated with multidrug resistance of leukemia.MethodsDifferential expression genes between leukemia cell line K562 and resistant cell lines K562/DOX were isolated by using suppression subtractive hybridization(SSH) technique.Total RNA were extracted.cDNA were synthesized and digested by restriction enzyme RsaⅠ,then connected with adopter1 and adopter2R,and linked with pMD19-T vector.Constructed vectors were transferred into E.coli.Subtracted cDNA library was constructed，and the positive clones were screened according to base sequences and homologous sequences.The differential expression genes were indentified by comparison analysis of Gene Bank database.ResultsA total of 220 differential expression genes were sequenced,including hemoglobin，ribosomes and mitochondria related genes,and heat shock factor binding protein 1 (HSPB1) gene and other genes.ConclusionSSH method and molecular cloning technique could be used to construct subtracted cDNA library of differential expression genes between drug resistant and not-resistant leukemia cells,which might be useful for further screening and cloning of differential expression genes of multidrug resistant tumor cells.

Key words:leukemia；multidrug resistance；suppressive subtractive hybridization；differential expression genes

(收稿日期：2015-11-13)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.010

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0743-04

作者簡介：王楠，女，主管技師，主要從事惡性血液病的實驗室研究。(△)通訊作者，E-mail：494701814@qq.com。