水陸二仙丹水提物對(duì)人精子膜結(jié)構(gòu)和功能氧化損傷的保護(hù)作用

何碧英，彭　明

(中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山 528400)

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·論著·

水陸二仙丹水提物對(duì)人精子膜結(jié)構(gòu)和功能氧化損傷的保護(hù)作用

何碧英，彭明

(中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山 528400)

摘要:目的探討水陸二仙丹治療男性畸形弱精死精子癥的作用機(jī)制。方法選擇健康的精子作為模型，精子懸液分為維生素C組、正常組、模型組和水陸二仙丹水提物大、中、小劑量組,劑量分別為每1 mL含1.0、0.5和0.25 g生藥。應(yīng)用次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生活性氧，在有氧環(huán)境下，精子懸液與0.25 g/L維生素C及不同劑量(每1 mL含1.0、0.5和0.25 g生藥)的水陸二仙丹水提物共同孵育后，采用精子低滲膨脹試驗(yàn)，對(duì)各組精子膜功能進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)檢測(cè)各組丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果與模型組相比，維生素C組及水陸二仙丹水提物大、中、小劑量組1、3及6 h的精子膨脹率及精子活率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且水陸二仙丹水提物中劑量組(0.5 g/mL)的精子膨脹率及精子活率顯著高于維生素C組(P<0.05)。與模型組相比，維生素C組及水陸二仙丹水提物大、中、小劑量組MDA的水平均顯著降低(P<0.05)，SOD活力均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且中劑量水陸二仙丹水提物(0.5 g/mL )的作用明顯優(yōu)于維生素C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論水陸二仙丹水提物具有保護(hù)精子膜功能和結(jié)構(gòu)的作用，其作用與干預(yù)精子膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:水陸二仙丹；活性氧；精子；脂質(zhì)過(guò)氧化

隨著人們對(duì)男性生殖健康的關(guān)注，精子氧化損傷和抗氧化劑在男性生殖系統(tǒng)中的應(yīng)用引起廣泛的研究探討[1]。在正常情況下，精子產(chǎn)生少量的活性氧(ROS)，這些活性氧是受精、頂體反應(yīng)和獲能的必要條件。然而，如果精子產(chǎn)生的ROS增加超過(guò)自身清除能力的增加，就會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)膜的過(guò)氧化損傷和DNA完整性的丟失，最終導(dǎo)致精子細(xì)胞死亡、降低受精率。研究發(fā)現(xiàn)，很多補(bǔ)益藥具有抗氧化作用。水陸二仙丹載于《洪氏集驗(yàn)方》，金櫻子澀、酸、平，功能澀腸止瀉、固精縮尿止帶，芡實(shí)澀、甘、平，功能健脾止瀉、益腎固精、除濕止帶[2-3]，臨床治療多種男科疾病療效顯著。本文旨在觀察水陸二仙丹水提物對(duì)人精子膜的影響，從精子膜角度探討治療男性不育癥的機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料自愿供精者50名，年齡22～32歲，有生育能力，身體健康，禁欲4～6 d，收取足夠量的精液到無(wú)菌容器中，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)常規(guī)分析，白細(xì)胞小于1×106/mL，正常形態(tài)精子大于60%，精子密度大于60×106/mL，a+b級(jí)精子大于50%，a級(jí)精子大于25%。制備具有正常生理功能的精子作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肞ercoll梯度離心法。具體操作方法見參考文獻(xiàn)[4]。

1.2試驗(yàn)藥物及其制備水陸二仙丹組方：芡實(shí)30 g，金櫻子30 g，水提取液由北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科配制。制法：按處方比例取芡實(shí)、金櫻子，加10倍量水浸泡30 min，加熱煎煮1 h，過(guò)濾，取濾液備用。藥渣再加8倍量水，煎煮30 min，過(guò)濾，濾液合并，濃縮至每l mL含1 g生藥，靜置沉降24 h，過(guò)濾取上清液。

1.3方法將精子懸液分為6份，分別加入到以下6組中。水陸二仙丹大、中、小劑量組；HX-XO(終濃度/水平同模型組)+水陸二仙丹水提物(終水平分別為每1 mL含1.0、0.5、0.25 g)；維生素C(終水平為0.25 g/L)+HX-XO(終濃度/水平同模型組)為陽(yáng)性藥對(duì)照組；模型組，HX-XO(HX終濃度為1 mmol/L,XO終水平為50 U/L)；正常組，PBS緩沖液(pH 7.4)；制作出來(lái)的精子標(biāo)本均放入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)1～2 h。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1T-SOD的活力處理好的精子懸液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用紫外分光光度計(jì)(7530G)測(cè)定T-SOD的活力。對(duì)照管和測(cè)定管分別加入試劑盒中1～4號(hào)試劑，適當(dāng)處理后倒入1 cm光徑比色杯，波長(zhǎng)550 nm處比色，抑制反應(yīng)50%的SOD量為SOD活力單位，比較每毫升酶單位。計(jì)算公式和具體操作方法見參考文獻(xiàn)[4]。

1.4.2MDA水平處理好的精子懸液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用紫外可見分光光度計(jì)(7530G)測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書操作。標(biāo)準(zhǔn)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管分別加入試劑盒中的1號(hào)試劑。標(biāo)準(zhǔn)空白管加入無(wú)水乙醇，標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)管，測(cè)定管加入精子懸液。適當(dāng)處理后分別加入到光徑比色杯中(1 cm)，用蒸餾水調(diào)零，在波長(zhǎng)為532 nm的條件下比色。MDA的產(chǎn)量能夠表示精子膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的情況，對(duì)其進(jìn)行定量。計(jì)算公式見參考文獻(xiàn)[4]。1 nmol代表1×108個(gè)精子。

1.4.3精子的低滲膨脹實(shí)驗(yàn)選取待檢標(biāo)本0.1 mL，經(jīng)過(guò)一定的處理后，在電子顯微鏡(高倍鏡)下計(jì)數(shù)b～g型精子的百分水平，觀察數(shù)目為200個(gè)精子。

1.4.4精子存活率處理后的精子懸液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1、3、6 h后，取5 μL精子懸液與5 μL 0.5%伊紅Y溶液混合均勻，在22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育2 min后加上蓋玻片，在400倍的顯微鏡下，采用明視野觀察，可以看到死精子被染成了紅色，而活精子沒(méi)有顏色。通過(guò)觀察計(jì)數(shù)300個(gè)精子，然后計(jì)算精子存活率。

2結(jié)果

2.1水陸二仙丹水提物對(duì)MDA水平、T-SOD活力的影響水陸二仙丹水提物大、小劑量組與維生素C組精子懸液中T-SOD活力和MDA水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但水陸二仙丹水提物中劑量組對(duì)精子懸液中T-SOD活力和MDA水平的影響則顯著優(yōu)于維生素C組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　　各組T-SOD活力、MDA水平比較

*1：P<0.05，與正常組比較；△：P<0.05，與模型組比較；#：P<0.05，與維生素C組比較。

2.2水陸二仙丹水提物對(duì)精子尾部低滲膨脹實(shí)驗(yàn)的影響將活性氧與精子懸液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，精子的結(jié)構(gòu)和功能均出現(xiàn)了明顯的受損現(xiàn)象。維生素C組與水陸二仙丹水提物大、中、小劑量組對(duì)精子總膨脹率的影響比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，甚至已接近正常者水平。維生素C組與水陸二仙丹水提物大、小劑量組對(duì)g型精子膨脹率的影響比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但水陸二仙丹水提物組中劑量組g型精子膨脹率顯著優(yōu)于維生素C組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　　各組精子尾部低滲膨脹結(jié)果比較(%)

*1：P<0.05，與正常組比較；△：P<0.05，與維生素C組比較。

2.3水陸二仙丹水提物對(duì)精子存活率的影響維生素C組與水陸二仙丹水提物大、小劑量組1、3、6 h的精子存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；水陸二仙丹水提物中劑量組的精子活率顯著高于維生素C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。水陸二仙丹水提物中劑量組的精子存活率相對(duì)保持在較高水平，與正常組精子存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3　　各組1、3、6 h樣品中精子存活率比較(%)

*1：P<0.05，與正常組比較；△：P<0.05，與維生素C組比較。

3討論

精子膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性在一定程度上決定精子受精能力的大小，常作為評(píng)價(jià)精子治療好壞的一個(gè)指標(biāo)[5-6]。精子膜結(jié)構(gòu)是精子新陳代謝、活動(dòng)力完整的基礎(chǔ)，也是完成頂體反應(yīng)和正常受精形成受精卵的必要條件[7]。人精子膜的流動(dòng)性依靠其中的多聚不飽和脂肪酸，若多聚不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)遭到破壞，精子和卵細(xì)胞就不能正常融合，阻礙受精卵的形成[8]，在氧化應(yīng)激的條件下，多聚不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)極容易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而引起精子膜損傷。正常生理?xiàng)l件下，自由基的產(chǎn)生與清除維持動(dòng)態(tài)平衡，一旦機(jī)體內(nèi)自由基過(guò)量，超過(guò)機(jī)體本身的清除能力時(shí)，則會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化，造成組織、器官或細(xì)胞的損傷。T-SOD作為細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫或者氧，反映機(jī)體本身清除自由基的能力[9-10]，而MDA是自由基水平過(guò)高造成氧化損傷的標(biāo)志性產(chǎn)物，其量的高低直接反映了機(jī)體受氧化損傷的程度。在生殖系統(tǒng)內(nèi)，由于氧化應(yīng)激引起的MDA水平過(guò)高也會(huì)對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)揮產(chǎn)生不利影響[11-12]。

水陸二仙丹由金櫻子和芡實(shí)由金櫻子和芡實(shí)兩味中藥組成，兩者均有很好的抗氧化活性[13-14]，在傳統(tǒng)應(yīng)用中，其可用于男科疾病陽(yáng)痿遺精，鑒于此，本試驗(yàn)從通過(guò)觀察精子膜結(jié)構(gòu)及功能的影響，探討水陸二仙丹水提物治療男性不育癥的機(jī)制。研究表明，精子活力下降的重要原因是精子膜結(jié)構(gòu)中多聚不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)[15-16]。因此，本試驗(yàn)對(duì)各組中MDA水平及T-SOD活力進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)各組1、3、6 h的精子膨脹率及存活率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與正常組比較，氧化損傷狀態(tài)下的精子膨脹率及精子存活率明顯降低(P<0.05)，MDA水平顯著增高(P<0.05)，T-SOD活力顯著降低(P<0.05)。經(jīng)維生素C及不同劑量的水陸二仙丹水提物作用后，與模型組相比，1、3、6 h的精子膨脹率及精子活率明顯升高(P<0.05)，且水陸二仙丹水提物中劑量組的精子膨脹率及精子活率顯著高于維生素C組，這表明水陸二仙丹水提物對(duì)人精子膜的體外運(yùn)動(dòng)能力有一定保護(hù)及促進(jìn)作用，且以0.5 g/mL水陸二仙丹水提物作用效果最佳。MDA及T-SOD活力測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)維生素C及不同劑量的水陸二仙丹水提物作用后，與模型組相比，MDA的水平均顯著降低(P<0.05)，SOD活力顯著升高(P<0.05)，且中劑量水陸二仙丹水提物的作用明顯優(yōu)于維生素C組(P<0.05)，提示水陸二仙丹水提物可增加精子SOD活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，這可能是水陸二仙丹水提物保護(hù)精子膜結(jié)構(gòu)及功能的氧化損傷作用的一個(gè)環(huán)節(jié)，且水陸二仙丹水提物作用效果最佳。

綜上所述，水陸二仙丹水提物具有保護(hù)精子膜功能和結(jié)構(gòu)的作用，其作用與干預(yù)精子膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。

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Protective effect of extract from Shuilu Erxiandan on oxidative injury of structure and function of human sperm membrane

HeBiying,PengMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,theTraditionalMedicineHospitalofZhongshanCity，Zhongshan,Guangdong528400,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of Shuilu erxiandan against male′s infertility and asthenoospermia.MethodsHuman sperm with normal physiological function were collected，and then sperm suspension were divided into the normal group,the model group,Vitamin C group and the groups of large,medium and small dose of Shuilu erxiandan.The reactive of species was made from hypoxanthine-xanthine oxidase.In the oxygen environment,Vitamin C(0.25 g/L) and different content(1.0,0.5,0.25 g/mL) of extract from Shuilu erxiandan were hatched with sperm.Then the function of sperm membrane in every group was evaluated using hypoosmoticswelling.Meanwhile the content of MDA and SOD were detected.ResultsExpansion of sperm and sperm motility in all the groups of vitamin C and large,medium and small dose of Shuilu erxiandan′s extract were significantly higher than that in the model group at time point of 1,3 and 6 h (P<0.05).Also,medium dose of Shuilu erxiandan (0.5 g/mL) displayed more effective on expansion of sperm and sperm motility compared with that in the vitamin group C (P<0.05).All the groups of vitamin C and large,medium and small dose of Shuilu erxiandan′s extract significantly indicated descreased MDA content and improved SOD activity compared with that in the model group (P<0.05).Also,this effect of medium dose of Shuilu erxiandan (0.5 g/mL) on MDA and SOD activity were superior to that in vitamin C group,which showed significant difference (P<0.05).ConclusionExtract from Shuilu erxiandan could significantly protect structure and function of sperm membrane,which is correlated with intervening its lipin peroxidation.

Key words:Shuilu erxiandan；active oxygen；sperm；lipin peroxidation

(收稿日期：2015-11-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.017

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)06-0760-03

作者簡(jiǎn)介：何碧英,男,主管技師,主要從事臨床方向研究。