電化學發(fā)光技術測定25羥基維生素D的性能驗證

向　波，劉忠民，覃潤東

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510120)

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·臨床研究·

電化學發(fā)光技術測定25羥基維生素D的性能驗證

向波，劉忠民，覃潤東

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510120)

摘要:目的對電化學發(fā)光技術檢測25羥基維生素D項目進行性能驗證，以確保實驗室檢測結果的準確。方法依據(jù)國家標準文件，對電化學發(fā)光技術檢測25羥基維生素D的精密度、正確度、線性范圍、參考區(qū)間進行驗證試驗。結果高、低濃度的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為3.18%和3.38%，批間變異系數(shù)分別是13.37%和6.23%，均小于廠家聲明的不精密度或驗證值；正確度驗證試驗偏倚未超過原衛(wèi)生部規(guī)定的最大允許誤差的1/2；驗證的線性范圍為3.165～48.515 ng/mL；參考范圍驗證20份體檢標本檢測結果均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)。結論電化學發(fā)光技術檢測25羥基維生素D項目性能驗證通過，可用于臨床檢測。

關鍵詞:25羥基維生素D；性能驗證；精密度;電化學發(fā)光技術

維生素D狀態(tài)評估是防止骨質疏松癥的基礎環(huán)節(jié)，眾多研究均強調良好的維生素D狀態(tài)對骨骼健康和長期接受抗骨質疏松治療非常重要。在老年人常見的高血壓、腫瘤(前列腺癌、結腸癌、乳腺癌等)、糖尿病、多發(fā)性硬化、免疫功能失調等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，維生素D也起重要作用。血清25羥基維生素D是評估維生素D狀態(tài)的最佳指標[1]。本實驗室擬開展25羥基維生素D檢測項目。按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證(WS/T 420-2013)》要求，臨床實驗室使用廠家已經(jīng)過嚴格評估的檢驗方法或試劑盒之前，還要驗證相關分析性能以證實在本實驗室能達到廠家聲稱的分析性能指標，從而保證檢驗結果準確。因此本實驗室對電化學發(fā)光技術檢測25羥基維生素D的精密度、正確度、線性范圍、生物參考區(qū)間進行驗證。

1材料與方法

1.1標本來源選擇2014年8月1日至10月31日在本院就診患者和體檢者的新鮮血清和中山大學附屬第一醫(yī)院(以下簡稱中大附一醫(yī)院)體檢者的新鮮血清，標本無溶血、黃疸、脂濁。

1.2儀器與試劑德國Roche公司Modular E170全自動電化學發(fā)光免疫分析儀，所用試劑為儀器原裝配套試劑盒、定標液、質控液。

1.3方法

1.3.1精密度驗證選擇低濃度(批號173190)和高濃度(批號173191)兩個濃度水平的質控品，試驗持續(xù)5 d，每批每個水平重復測定3次，計算批內(nèi)不精密度、批間不精密度。若實測結果小于廠家聲明的不精密度或驗證值，則結論為精密度驗證通過。

1.3.2正確度驗證本科室與使用相同檢測系統(tǒng)的中大附一醫(yī)院檢驗中心進行結果比對，在獲取的20份標本中隨機抽取5份已在中大附一醫(yī)院檢驗中心測定25羥基維生素D的標本，在本實驗室進行測定，得出結果進行對比，若結果偏倚未超過允許范圍，驗證通過。

1.3.3線性范圍驗證選擇低(L)、高(H)濃度水平混合血清(盡可能接近說明書的線性高低值)，按比例配制成系列濃度的6個標本：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H。在質控在控的情況下，每個標本重復測定2次。判斷標準：預期值與實測值作回歸統(tǒng)計，斜率在0.97～1.03并且R2≥0.95則認為在該濃度范圍內(nèi)呈線性。

1.3.4生物參考區(qū)間驗證表面健康人入選原則：從既往檢驗人員中獲取20例表面健康者，考慮性別和年齡分布。具體人員情況：共20例。其中男10例，年齡21～70歲；女10例，年齡23～69歲。判斷標準：若20份標本的檢測結果均在廠家提供的參考范圍內(nèi)，則實驗室可直接使用廠家提供的參考范圍。

2結果

2.1精密度驗證批內(nèi)及批間不精密度結果見表1,批內(nèi)及批間標準差與驗證值見表2。

表1　　批內(nèi)及批間不精密度

2.2正確度驗證5份標本比對結果見表3。

2.3線性范圍驗證維生素D的低值和高值分別是3.16、48.52 ng/mL。統(tǒng)計軟件多項式回歸數(shù)據(jù)擬合結果顯示：線性方程為Y=1.002 9X+0.069 3，R2為0.999 1，斜率為1.003。見表4。

表2　　批內(nèi)及批間標準差與驗證值比較

2.4生物參考區(qū)間驗證廠家提供的參考范圍：>20 ng/mL;20份體檢標本檢測結果最低值為20.55 ng/mL，最高值為50.28 ng/mL，均值為30.90 ng/mL。

表3　　正確度驗證結果

表4　　線性試驗的實測均值與預期值

3討論

維生素D有廣泛的生理作用，不僅可以維持鈣、磷濃度的穩(wěn)定，促使骨的礦化，還能誘導細胞分化、抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡以及免疫調節(jié)作用，是癌癥和其他慢性疾病風險的獨立預示因子[2]。如有文獻報道，宮頸癌患者的維生素D水平顯著低于健康人群[3]。維生素D因與陽光關系密切，又稱為陽光維生素[4]。但是近年由于環(huán)境污染加劇、霧霾天氣增加等因素，人類從大自然中攝取維生素D的途徑越來越少[5]。因此，實驗室及時開展維生素D檢測，監(jiān)測人體的維生素D水平，對預防疾病、維護機體健康有著重要意義。

根據(jù)2003年CLIA′88更新說明，由FDA證實的、未被修改的中等復雜的檢驗項目，在實驗室報告患者結果前，需檢查(確認)在產(chǎn)品說明書中的廠商性能指標：正確度、精密度、可報告范圍、參考范圍。我國的衛(wèi)生行業(yè)標準也明確提出：臨床實驗室應在正式使用商品定量試劑盒前，對廠家聲稱的各項主要分析性能指標進行驗證，依據(jù)CLIA′88要求，臨床實驗室可只對正確度、精密度和線性主要分析性能進行驗證[6]。本實驗室即依據(jù)以上標準，對25羥基維生素D檢測項目進行開展前的性能驗證。

本次精密度驗證嚴格按照國家標準文件《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證(WS/T 420-2013)》進行設計和結果判讀。如果計算值小于或等于廠家聲稱值，則驗證廠家聲稱的重復精密度可靠。如果計算值大于廠家聲稱值，則需將計算值與驗證值比較，如小于驗證值，說明此差異無統(tǒng)計學意義，表明廠家聲稱的重復精密度可靠。本試驗的精密度驗證批內(nèi)變異系數(shù)分別是3.18%和3.38%，均小于制造商聲明的批內(nèi)變異系數(shù)(6.50%和4.20%)；而批間變異系數(shù)分別是13.37%和6.23%，大于廠家聲稱值，但小于驗證值。因此，本實驗室電化學發(fā)光技術檢測25羥基維生素D精密度驗證通過。

本次正確度驗證是依據(jù)中國合格評定國家認可委員會CNAS-CL38-《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明》中5.6.3.2條款執(zhí)行:對沒有開展能力驗證/室間質評的檢驗項目，應通過與其他實驗室(如已獲認可的實驗室，使用相同檢測方法的實驗室，使用配套系統(tǒng)的實驗室)對比，判讀檢驗結果的可接受性。該條款要求：樣品數(shù)量至少5份，包括正常和異常水平，頻率至少每年2次，判定標準為應有不低于80%的結果符合要求[7]。25羥基維生素D屬于無室間質量評價項目，根據(jù)CNAS-CL38中5.6.3.2替代方案，本次正確度試驗選取的5份標本，偏倚均小于衛(wèi)生部最大允許誤差的1/2，正確度驗證通過。

本次線性范圍的驗證是嚴格按照國家標準文件《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證(WS/T 420-2013)》進行設計和結果判讀。當實驗室新使用一種試劑時，必須確定其線性范圍，因線性范圍寬窄對于定量檢測的臨床化學分析方法極為重要[8]。Roche公司對于25羥基維生素D聲明的線性范圍為3～70 ng/mL，由于臨床上患者高值標本十分缺少，無法滿足廠商提供的線性范圍。本試驗選取了盡量靠近試劑說明書的線性高低值，低值為3.165 ng/mL，高值為48.515 ng/mL。統(tǒng)計軟件多項式回歸數(shù)據(jù)擬合結果顯示：線性方程為Y=1.002 9X+0.069 3，R2為0.999 1，斜率為1.003。斜率在0.97～1.03并且R2≥0.95，本實驗室驗證的線性范圍為3.165～48.515 ng/mL。

本次生物參考區(qū)間的驗證是嚴格按照國家標準文件《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定(WS/T 402-2012)》進行設計和結果判讀。若實驗室希望或需要對參考區(qū)間進行驗證，則實驗室可以從本地參考人群中篩選少量參考個體(n=20)，將其測得值與參考區(qū)間的原始參考值相比較。若20個測定值中落在參考限外的測定值不超過2個，則該參考區(qū)間可直接使用[9]。本次生物參考區(qū)間驗證結果均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)，實驗室可直接使用廠家提供的25羥基維生素D參考范圍(>20 ng/mL)。

參考文獻

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[2]Fleet JC,DeSmet M,Johnson R,et al.Vitamin D and cancer:a review of molecular mechanisms[J].Biochem J,2012,441(1):61-76.

[3]蔡葉樨，張紅河，倪慧群，等.血漿Th17細胞相關因子與25-羥基維生素D檢測對宮頸癌的臨床價值[J].全科醫(yī)學臨床與教育，2014，12(3):263-265.

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[5]考驗，施衛(wèi)星，陳樞青.環(huán)境污染物質對兒童身高發(fā)育遲緩的影響[J].國際兒科學雜志，2009,36(5)：491-493.

[6]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準 臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證[S].北京：中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會,2013.

[7]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL38醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明[S].北京：中國合格評定國家認可委員會，2012.

[8]吳惠，吳炯，郭偉，等.臨床常用線性評價方案的應用比較[J].檢驗醫(yī)學，2006，21(6)：576-580.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準 臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定[S].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2012.

(收稿日期：2015-12-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.029

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0786-03