缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞能量代謝通路的差異

李澎瀛　張東陽　吳美玲　董克磊　施冬云

(復旦大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系　上海　200032)

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缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞能量代謝通路的差異

李澎瀛張東陽吳美玲董克磊施冬云△

(復旦大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系上海200032)

【摘要】目的比較缺氧條件下肝癌細胞與正常肝細胞能量代謝通路的差異,探索腫瘤細胞的耐缺氧機制。方法采用環境缺氧(0.2%O2缺氧培養箱)模擬腫瘤的體內環境,比較肝癌細胞株HepG2與原代分離的小鼠肝臟細胞在不同缺氧時間下的能量代謝情況。流式細胞術檢測各組活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,MTT法檢測各組細胞缺氧后細胞活力及生存率,real-time PCR方法檢測己糖激酶2(hexokinase 2)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase)等糖代謝關鍵酶及p53、TIGAR/Tigar、SCO2/Sco2基因的mRNA水平,NADH比色法檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)活性,氧電極法檢測各組細胞耗氧量,高效液相色譜法檢測細胞內ATP含量。結果缺氧后,腫瘤細胞HepG2與正常小鼠肝臟細胞相比生存率更高,活性氧增幅更小。兩種細胞在缺氧下耗氧量都下降,但肝癌細胞的ATP產量代償性增加,而正常肝細胞的ATP顯著下降;有氧氧化相關酶基因在缺氧小鼠肝臟細胞中代償性上調,而在缺氧HepG2細胞中下降;糖酵解相關酶基因在缺氧HepG2細胞中上調更迅速,幅度更大;進一步研究表明,缺氧時,小鼠肝臟細胞p53、Tigar、Sco2基因表達上調,而HepG2細胞p53、TIGAR、SCO2基因表達下調。結論在缺氧應激狀態下,正常細胞主要依賴有氧氧化補償能量,腫瘤細胞則主要依賴糖酵解。ROS或可通過調節腫瘤細胞p53/TIGAR、p53/SCO2通路及糖酵解關鍵酶活性促進Warburg效應與腫瘤耐缺氧能力。

【關鍵詞】腫瘤缺氧;能量代謝通路;活性氧;Warburg效應;小鼠

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31270901,30970684).

新生血管畸變導致血液供應不足,腫瘤與周邊正常組織最大的差別就是腫瘤內部的缺氧微環境。不同于正常組織,腫瘤在氧氣及養分不足的環境中仍得以存活生長,并獲得抗藥性。大量研究已證實,腫瘤部分區域極低濃度的氧氣反而會增加腫瘤的侵襲性行為和顯示更差的預后[1]。腫瘤細胞對缺氧的強耐受力被認為是腫瘤發展、侵襲、轉移的重要因素[2]。缺氧對組織細胞帶來的危害主要包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量增加以及氧氣不足造成的能量耗竭[3]。因此,缺氧腫瘤細胞維持自身代謝活動的方式便是研究腫瘤缺氧耐受能力的關鍵。

Warburg效應揭示了腫瘤細胞有氧糖酵解的獨特能量代謝方式。我們以前的研究發現[4-5],缺氧和活性氧可以上調細胞內的糖酵解通路,Warburg效應可能與氧化應激微環境相關。然而,腫瘤細胞究竟如何利用低效率的糖酵解滿足其體內快速生長所需要的能量需求,其機制尚不清楚。

p53在代謝通路調控中起重要作用。p53可轉錄激活Tigar蛋白,后者通過降解細胞內2,6-二磷酸果糖抑制糖酵解,使葡萄糖通量涌入PPP通路[4-6]。p53還可上調呼吸鏈復合物Ⅳ中的細胞色素C氧化酶組裝蛋白2(cytochrome C oxidase assembly protein,SCO2)[7],從而促進氧化磷酸化。我們推測缺氧腫瘤細胞可能通過p53/TIGAR和p53/SCO2通路調控缺氧腫瘤能量代謝。

本文采用環境缺氧方式(0.2% O2缺氧培養箱)模擬腫瘤內部的缺氧環境,比較腫瘤細胞與正常細胞在糖酵解、有氧氧化、能量生成、p53及其下游信號等方面的變化,探討腫瘤細胞缺氧耐受的產生機制,為腫瘤的靶向治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

實驗動物、細胞株與儀器SPF級昆明小鼠購自復旦大學實驗動物科學部[生產許可證號：SCXK(滬) 2014-0004];人肝癌細胞株HepG2購自ATCC細胞庫;三氣培養箱(德國Binder CB系列);CO2細胞培養箱(美國Thermo Forma公司);液相氧電極(Oxygraph,英國Hansatech公司);高效液相色譜HPLC系統(日本島津公司);高效液相色譜柱[ODS-SPC18(4.6 mm×250 mm,粒徑5 μm),日本島津公司];熒光定量PCR儀(7900HT,美國ABI公司);流式細胞儀(FC500,美國Beckman Coulter公司)。

小鼠肝臟細胞原代分離小鼠麻醉后剖開腹腔,暴露門靜脈并插入塑料導管,灌注37 ℃的Hanks平衡鹽溶液5～10 min以除去肝內血液。結扎下腔靜脈,并插入另一根塑料導管,同時結扎胸腔段靜脈。灌注37℃膠原酶消化液(Ⅳ型膠原酶,0.05%),待整肝鼓脹泛白后,撕去表面包膜并將肝細胞轉移至DMEM培養液(含10%FBS,105U/L青霉素與鏈霉素)。細胞懸液經200目不銹鋼濾網除去細胞團塊,并以上述DMEM培養液洗滌3次,低速離心(1 000 r/min,離心半徑為13 cm,5 min)收取純化肝細胞并接種于無菌細胞培養皿。接種4 h后更換細胞培養液。

細胞培養與缺氧HepG2細胞株在含有10% FBS DMEM培養液(含青霉素和鏈霉素各100 U/mL)中,于37 ℃、5% CO2條件下培養至貼壁面積達80%以上。使用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化后,按1∶2或1∶4比例傳代,貼壁4～6 h后備用。原代小鼠肝臟細胞自分離接種4 h后備用。將已貼壁細胞轉移放入常規細胞培養箱繼續培養24 h,作為缺氧0 h對照組;先于常規培養箱中繼續培養18 h,再轉入37℃、0.2% O2缺氧培養箱中培養6 h,作為缺氧6 h組;先于常規培養箱中繼續培養12 h,再轉入37℃、0.2% O2缺氧培養箱中培養12 h,作為缺氧12 h組;直接轉入37 ℃、0.2% O2缺氧培養箱中繼續培養24 h,作為缺氧24 h組。

MTT法檢測細胞活力取對數生長期細胞接種于96孔培養板,每孔200 μL細胞懸液(5×103細胞)。培養4～6 h待細胞貼壁后,每組設置至少3個平行孔。于培養常氧培養箱與缺氧培養箱中各培養24、48、72 h。達到缺氧時間后,迅速向各孔加入20 μL (5 mg/mL)MTT溶液,37 ℃孵育4 h后吸去各孔內溶液,加入150 μL DMSO,置搖床上低速震蕩10 min,待結晶充分溶解后,以DMSO調零,用多功能酶標儀檢測儀在490 nm處測定各孔吸光度D,并計算細胞存活率(survival rate,SR)。SR =實驗組D490/對照組D490×100%。

高效液相色譜(HPLC)檢測ATP含量細胞ATP樣品收集及HPLC檢測方法參考Zur等[8]的研究。

熒光定量PCR檢測胞內目的基因mRNA表達水平用冰冷PBS清洗細胞,按105～106細胞/mL加入Trizol試劑充分吹打,靜置10 min后轉入 1.5 mL離心管;加入200 μL氯仿,渦旋混勻,室溫靜置10 min;12 000 ×g 4 ℃離心15 min,上清(約500 μL)轉移至另一離心管;加500 μL異丙醇,震蕩混勻,室溫靜置10 min;12 000×g 4 ℃離心15 min,可見RNA絮狀沉淀,將上清小心棄去,并加入500 μL預冷的75%乙醇洗滌RNA沉淀1次,棄去乙醇,適度揮發后,用DEPC處理水溶解RNA,檢測RNA濃度并調整為2 μg /10 μL,置冰上備用。逆轉錄PCR體系按照DBI公司RT-PCR試劑盒(DBI-2226)說明書進行,反轉錄cDNA儲備液稀釋適當倍數后,按DBI公司熒光定量PCR試劑盒(DBI-2043)說明書配置熒光定量PCR體系并進行熒光定量PCR。

流式細胞術檢測細胞ROS水平細胞接種于6孔板,培養完成后,棄培養液,PBS清洗1次后棄盡,每孔加1 mL DCF工作液(10 μmol/L),鋪勻后避光37 ℃孵育20 min,后續步驟避光操作。洗棄DCF工作液,用PBS清洗細胞表面3次,胰酶消化收集細胞于500 μL PBS,冰浴送檢。設置流式細胞儀激發波長為488 nm,發射波長為525 nm,檢測各樣品的平均熒光強度,作為ROS水平的度量。

細胞耗氧量檢測設定氧電極溫度37 ℃,于檢測小室中加入2 mL純凈水并持續攪拌至溫度恒定且氧氣飽和。吸出檢測室內純凈水,加入2 mL細胞培養液攪拌至信號平衡,記錄培養液起始氧濃度。向檢測小室內注入100 μL樣品細胞懸液(含105細胞),并立即計時5 min,記錄溶解氧變化。

統計學分析所有數據使用SPSS 13.0統計軟件進行分析,采用Student’st檢測或One-way Anova方法進行檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞ROS水平及生存的差異隨缺氧時間延長,肝癌細胞與正常肝細胞的ROS水平均逐步提高,但正常細胞增加得更快,增幅更大。缺氧24 h組小鼠肝臟細胞的ROS水平是缺氧0 h組小鼠肝臟細胞的4倍,而缺氧24 h組HepG2細胞的ROS水平則僅為缺氧0 h組HepG2細胞的1.8倍。在此過程中,HepG2細胞各組的ROS水平始終高于同條件下的正常細胞組(圖1A)。缺氧條件下,兩種細胞的存活率都隨缺氧時間延長而減少,但小鼠肝臟細胞下降幅度更大,缺氧24 h組小鼠肝臟細胞的生存率已降至40%以下,而缺氧24h組HepG2細胞的生存率仍維持在80%左右,說明腫瘤細胞具有較強的缺氧耐受能力(圖1B)。

缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞在糖酵解通路相關基因的差異如圖2A所示,兩種細胞己糖激酶基因的水平在缺氧6 h、12 h時都代償升高,而在24 h則呈下降趨勢。圖2B表示,缺氧后HepG2細胞丙酮酸脫氫酶基因PKM2的水平比較穩定,缺氧24 h組HepG2細胞的PKM2表達與其缺氧0 h組差異無統計學意義(P>0.05),而缺氧24 h組小鼠肝臟細胞PKM2基因的表達與其缺氧0 h組相比則顯著降低(P<0.05)。如圖2C所示,缺氧后小鼠肝臟細胞及HepG2細胞LDH活力均隨缺氧時間延長而增加,且HepG2細胞增加更為迅速,漲幅更大。缺氧24 h組小鼠肝臟細胞的LDH活性是0 h組的10倍,而缺氧24 h組HepG2細胞的LDH活性則為0 h組的22倍以上。這些結果都說明在缺氧的情況下,相對于正常細胞,腫瘤細胞更傾向于通過糖酵解通路相關酶的表達或活性代償升高來補償能量供應的不足。

The introcellular ROS level(A) and survival curve (B) of mice hepatocellular and HepG2 under hypoxia. Cell viability (%control) represents the ratio of hypoxic cell viability to nomoxic cell viability being cultured for the same time.(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

圖1缺氧小鼠肝臟細胞與HepG2細胞的生存曲線與胞內ROS水平

Fig 1Survival rate and ROS level of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

圖2缺氧小鼠肝臟細胞與HepG2細胞的糖酵解水平

Fig 2The glycolysis level of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞在有氧氧化通路相關基因的差異如圖3A所示,兩種細胞異檸檬酸脫氫酶的基因水平在缺氧6 h時都呈現代償升高然后下降的趨勢。在缺氧12 h時,小鼠肝臟細胞Idh表達雖有回落,但仍與缺氧0 h對照組持平(P>0.05),而相同缺氧時長的HepG2細胞已經顯著低于其0 h對照組(P<0.05)。如圖3B所示,與IDH的基因表達相似,缺氧后HepG2琥珀酸脫氫酶SDH基因表達水平隨缺氧時間迅速下降,缺氧6 h組差異已出現統計學意義(P<0.05,vs. HepG2缺氧0 h組),而小鼠肝臟細胞Sdh表達水平直到缺氧12 h依然處于代償性升高,與其缺氧0 h組差異無統計學意義(P>0.05)。進一步說明在缺氧的情況下,正常細胞比腫瘤細胞更依賴于有氧氧化通路。此結果說明與腫瘤細胞不同,正常細胞在缺氧的情況下主要依靠有氧氧化通路代償性升高來補償能量供應的不足。

缺氧條件下肝癌細胞和正常肝細胞在耗氧率與ATP生成的差異如圖4A所示,隨缺氧時間的延長,兩種細胞的耗氧率都顯著降低(P<0.05),但HepG2細胞的耗氧率始終顯著高于小鼠肝臟細胞,說明在缺氧的情況下,腫瘤細胞消耗的氧氣仍比正常細胞多。 如圖4B所示,兩種細胞在缺氧時ATP生成量的變化截然相反。缺氧后,HepG2細胞的ATP的生成代償性升高,直至24 h依然不低于其缺氧0 h組(P>0.05)。而小鼠肝臟細胞ATP含量則隨缺氧時間迅速下降。說明在缺氧的情況下,腫瘤細胞依然能產生足夠的ATP,而正常細胞則可能已經處于ATP匱乏的狀態。缺氧24 h內,腫瘤細胞耗氧率的下降與ATP的增加,說明這部分增加的ATP可能主要來自于糖酵解。

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

圖3缺氧小鼠肝臟細胞與缺氧HepG2細胞的有氧氧化關鍵酶的基因表達

Fig 3The expression of key enzymes involved in aerobic oxidation in mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

The oxygen consumption rate (A) and ATP production of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia (B). All values were mean±SD.(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3);(3)vs. hepatocytes 6 h group,P<0.05;(4)vs. HepG2 6 h group,P<0.05 (n≥3).

圖4缺氧小鼠肝臟細胞與缺氧HepG2細胞的能量代謝狀態

Fig 4The energy metabolism state of mice hepatocytes and HepG2 cells under hypoxia

腫瘤細胞對缺氧耐受與p53、tigar及sco2基因表達相關如圖5,小鼠肝臟細胞p53、tigar、sco2的基因mRNA水平在缺氧12 h后分別增長為缺氧0 h對照組的1.7倍、1.22倍與4.29倍,差異具有統計學意義(P<0.05)。這3種基因在缺氧12 h組HepG2細胞內表達變化則截然相反。相比于缺氧0 h組,缺氧12 h組HepG2細胞p53、TIGAR、SCO2的基因mRNA水平分別降低了36%、63%和46%,差異具有統計學意義(P<0.05)。

討論

腫瘤細胞生長增殖迅速,而血管生成相對滯后,且新生血管普遍存在異常,這種情況導致了腫瘤細胞大多數情況下處于缺氧及養分供應不足的微環境中。細胞在缺氧環境中會經歷一系列生理變化,缺氧嚴重時則會引發凋亡。腫瘤細胞在衍變過程中產生了對缺氧微環境較強的耐受能力,使其不僅可以存活而且能維持一定程度的增殖,同時還伴隨著惡化轉移[1]及放化療抗性,我們的實驗結果也證實了腫瘤細胞具有更高的缺氧生存率(圖1B)。因此,腫瘤細胞對于缺氧應激所做出的各種適應性應答將為有效的抗癌療法提供靶點。本研究采用0.2%環境氧濃度對細胞進行缺氧處理。在該濃度下平衡的無細胞培養液溶解氧濃度為32 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa,下同),介于人體內正常組織氧分壓60 mmHg與腫瘤內部氧分壓15 mmHg之間[9-10]。

(1)vs. hepatocytes 0 h group,P<0.05;(2)vs. HepG2 0 h group,P<0.05 (n≥3).

圖5缺氧小鼠肝臟細胞與缺氧HepG2細胞p53,TIGAR/Tigar及SCO2/Sco2基因表達

Fig 5The expression ofp53,TIGAR/TigarandSCO2/Sco2 in mice hepatocytes or HepG2 cells under hypoxia

缺氧對組織細胞帶來的危害之一是氧氣不足造成的能量耗竭[11]。ATP含量是細胞能量產出的直接指標,本研究通過對比腫瘤細胞與正常細胞在缺氧后ATP產量的變化,探究兩者能量產出受缺氧環境的影響程度。研究結果表明(圖4B),缺氧腫瘤細胞的能量耗竭速率要遠低于正常細胞。相比于正常細胞迅速降低的ATP含量,腫瘤細胞ATP含量在短時間缺氧時甚至還出現一定程度的代償性增加。細胞ATP產出來源于糖酵解通路及線粒體有氧氧化,1分子葡萄糖經由糖酵解通路分解為丙酮酸,產出2個ATP,丙酮酸在氧氣充足的條件下進入線粒體繼續氧化,此過程中可直接或間接地生成36個ATP。因此,線粒體有氧氧化是需氧生物能量產出的主要來源。然而,本研究發現正常細胞與腫瘤細胞在缺氧后耗氧量均受到抑制(圖4A),而腫瘤細胞在耗氧量降低的同時ATP產出卻是大幅增加的,說明腫瘤細胞通過線粒體有氧氧化以外的其他方式有效地補償了線粒體能量產出的不足,即糖酵解通路,以此維持缺氧條件下自身的能量供應。

IDH與SDH是細胞參與有氧氧化的重要成員,前者參與三羧酸循環(TCA cycle),將NAD還原為NADH,SDH既是TCA循環成員,同時也是線粒體傳遞鏈的復合體2。本實驗對比了缺氧后正常細胞與腫瘤細胞IDH/Idh與SDH/Sdh基因的表達,用以說明細胞內有氧氧化水平。結果表明(圖3)缺氧后的正常細胞會通過提高有氧氧化相關基因的表達水平,來彌補氧氣缺失所造成的能量產出不足,說明正常細胞在缺氧環境中仍然主要依靠有氧氧化功能。然而,這顯然并不能長久維持,隨著缺氧時間的延長,以氧氣作為最終電子受體的呼吸鏈受阻,導致細胞能量耗竭而死亡。Warburg效應的提出揭示了腫瘤細胞不同于正常細胞的代謝方式,該假說認為,腫瘤細胞即便在氧氣充足的條件下也依賴糖酵解供能的原因在于線粒體缺陷,說明腫瘤細胞已不以線粒體呼吸作為主要能量產出方式。本研究中,與正常小鼠肝臟細胞不同,腫瘤細胞HepG2在缺氧后IDH與SDH基因表達水平迅速下調。我們推測,缺氧腫瘤細胞有氧氧化相關酶的下調,使得TCA循環減慢,減少了TCA循環產物NADH對呼吸鏈的遞氫量,不但降低了缺氧狀態下細胞在有氧氧化通路上不必要的物料浪費,將葡萄糖更多地送入無氧糖酵解與磷酸戊糖通路(pentose phosphate pathway,PPP),同時也阻止了由于呼吸鏈受阻、電子溢出而導致的ROS大量增加,降低細胞缺氧損傷。本研究的結果也驗證了這一觀點,腫瘤細胞缺氧后ROS增幅小于正常細胞(圖1A),兩種細胞糖酵解相關酶HK2/Hk2、PKM2/Pkm2基因表達水平均上調,但腫瘤細胞上調幅度更大(圖2A、2B),其無氧糖酵解末端酶LDH活性也大幅上調,增幅遠高于正常細胞(圖2C)。這些結果說明,缺氧條件下正常細胞仍依賴有氧氧化代償增加補充能量,而腫瘤細胞則依賴迅速高度活化的無氧糖酵解。

我們以前的研究表明[12],缺氧可誘導ROS釋放,并可通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1)上調細胞內的糖酵解通路,說明腫瘤Warburg效應可能與其缺氧氧化應激微環境相關。此外,ROS也被發現可通過調節p53基因影響細胞生長。p53是一種重要的腫瘤抑制基因,且有超過半數以上的惡性腫瘤被發現存在p53突變,失去了對細胞生長凋亡的調控作用[13-14]。 但近年來發現p53可以通過誘導TIGAR降解2,6-二磷酸果糖從而抑制糖酵解,并可活化SCO2提升有氧氧化,在腫瘤能量代謝中起重要調控作用[15-16]。本研究對比了缺氧后腫瘤細胞與正常細胞P53/p53、TIGAR/Tigar及SCO2/Sco2的mRNA表達量(圖5),結果與設想一致,正常細胞缺氧12 h后p53基因表達上調,Tigar基因表達也隨之上調,提示正常細胞缺氧后糖酵解通路可能因2,6-二磷酸果糖的降解而受到抑制。由于2,6-二磷酸果糖處于己糖激酶的下游,故Tigar表達上調并不會影響Hk2的基因表達,且Tigar與Hk2表達共同上調可進一步促進葡萄糖通量涌入PPP通路。因此,正常細胞缺氧己糖激酶基因表達代償性增加并非主要用于補充能量,而是用于促進PPP通路產生更多的NADPH以對抗缺氧產生的ROS。但此代償作用并不持久,缺氧24 h后,正常細胞Hh2與其Pkm2基因表達一樣,受到了顯著抑制。此外,缺氧12 h后正常細胞Sco2的mRNA水平大幅提升,這與正常細胞缺氧后Idh、Sdh基因表達代償性增加的結果一致,說明正常細胞缺氧后通過有氧氧化代償補充能量。與正常細胞不同,本研究中腫瘤細胞p53、TIGAR、SCO2基因均降低。Tigar基因的降低穩定了2,6-二磷酸果糖對糖酵解通路的促進作用,處于下游的PKM2基因表達穩定(圖2B),LDH活性大幅增加(圖2C),說明缺氧腫瘤細胞極大地增加提高了無氧糖酵解水平,原本進入線粒體繼續氧化的丙酮酸轉而大量生成乳酸。此過程雖然產能低效,卻很大程度上通過降低有氧氧化及NADH生成,阻止NADH在缺氧的環境下向線粒體持續遞氫,防止電子傳遞鏈由于電子終受體氧分子不足而大量溢出,保護線粒體不受電子溢出所產生的ROS損傷,抑制線粒體介導的細胞凋亡。本研究中,相對于正常細胞,腫瘤細胞的ROS水平在缺氧后更為穩定也進一步證實了此觀點(圖1A)。即便如此,腫瘤細胞的ROS水平始終是高于正常細胞的,暗示了ROS在腫瘤細胞中的重要作用。結合ROS對p53、HIF-1等基因的多重調控作用,以及我們早期對ROS調控p53基因表達的研究[17],仍可認為腫瘤細胞所維持的一定量ROS參與調控了腫瘤細胞缺氧能量代謝及缺氧耐受。

本研究發現在缺氧應激狀態下,細胞可通過代償性提高能量代謝通路來補償能量供應,正常細胞主要依賴有氧氧化補償能量,而腫瘤細胞則主要依賴糖酵解。缺氧腫瘤細胞獨特的能量代謝方式可能歸因于ROS參與調控的p53/TIGAR及p53/SCO2通路,這不僅可維持其能量供應,還降低了缺氧應激對線粒體的損傷,抑制線粒體介導的細胞凋亡(圖6)。這一發現為腫瘤細胞缺氧耐受能力提供了理論基礎,并一定程度上解釋了腫瘤Warburg效應,為腫瘤的靶向治療提供了思路,但ROS參與腫瘤細胞缺氧能量調節及缺氧耐受能力形成的具體方式、作用節點等問題,仍需進一步研究和探討。

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The difference of energy metabolism pathways between normalhepatocytes and hepatoma cells under hypoxia

LI Peng-ying, ZHANG Dong-yang, WU Mei-ling, DONG Ke-lei, SHI Dong-yun△

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the difference between energy metabolism pathways of hypoxic normal hepatocytes cells and tumor cells, and try to understand the underlying mechanism of tumor hypoxia resistance.MethodsWe adopted environmental hypoxia (Hypoxia incubator with 0.2%O2) to mimic the tumor environment in vitro,and compared the difference of energy metabolism response to hypoxic stress between HepG2 cells and mice hepatocytes.Flow cytometry was used to detect the level of different kinds of ROS.MTT was used to compare the viability of cells before and afterhypoxia.The mRNA level of p53,Tigar,SCO2, and key enzymes in the metabolism including hexokinase 2 and isocitrate dehydrogenase,were detected by real-time PCR.NADH colorimetric assay was used to detect lactate dehydrogenase activity.Oxygen electrode was used to detect the oxygen consumption rate of cells.HPLC was used to detect the ATP levels in cells.ResultsUnder moderate hypoxia, HepG2 cells had a higher survival rate and underwent a more steady reactive oxygen species (ROS) fluctuation. The oxygen consumption rate declined in both types of cells, ATP production in hepatoma cells increased with cellular proliferation being maintained,but decreased significantly in normal liver cells. The results also showed that key enzymes involved in aerobic oxidation were compensatively increased in normal liver cells but decreased in hepatoma cells under hypoxia. The key enzymes involved in glycolysis were both upregulated in response to hypoxia, but the hepatoma cells increased more significantly. Further studies showed that in response to hypoxia, the mRNA expression of p53,Tigar and Sco2 were all upregulated in normal liver cells but p53,TIGAR and SCO2 downregulated in hepatoma cells.ConclusionsUnder hypoxia stress, normal cells mainly depend on aerobic oxidation to compensate the energy, but hepatoma cells mainly rely on glycolysis. ROS may enhance glycolysis through p53/TIGAR and p53/SCO2 pathways, so as to promote the Warburg effect and hypoxia tolerance.

【Key words】tumor hypoxia;energy metabolism pathway;reactive oxygen species;Warburg effect;mouse

(收稿日期:2015-11-24;編輯:王蔚)

【中圖分類號】R730

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.001

國家自然科學基金(31270901, 30970684)

△Corresponding authorE-mail:dyshi@fudan.edu.cn