慢病毒shRNA靶向干擾RegⅣ基因胰腺癌細胞株的構建

李　健　胡啟立　徐　凌　衛　巍　趙　嚴　劉　華　湯茂春　宋振順　夏小俊　王興鵬,5　王　鋒△

(1同濟大學附屬上海市第十人民醫院普外科,2消化內科，4急診科　上海　200072; 3上海交通大學醫學院附屬

同仁醫院消化內科　上海　200336;5上海交通大學附屬上海市第一人民醫院消化內科　上海　200080)

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慢病毒shRNA靶向干擾RegⅣ基因胰腺癌細胞株的構建

李健1胡啟立1徐凌2,3衛巍4趙嚴2劉華2湯茂春2宋振順1夏小俊2王興鵬2,5王鋒2△

(1同濟大學附屬上海市第十人民醫院普外科,2消化內科，4急診科上海200072;3上海交通大學醫學院附屬

同仁醫院消化內科上海200336;5上海交通大學附屬上海市第一人民醫院消化內科上海200080)

【摘要】目的構建并鑒定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短發夾干擾RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體,繼而建立穩定干擾RegⅣ基因表達的胰腺癌細胞株PANC-1。方法使用聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction,PCR)檢測RegⅣ基因在胰腺癌細胞株中的表達情況。構建重組靶向干擾RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表達質粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂質體轉染的方法將載體導入胰腺癌細胞,建立穩定表達shRNA的細胞株。使用熒光定量PCR檢測干擾效率。RegⅣ基因過表達載體的構建方法為:將獲取的目的基因與pEGFP-RegⅣ-3FLAG過表達質粒載體分別進行雙酶切,利用電泳回收雙酶切產物,轉化感受態細胞并進行測序驗證,驗證成功后,使用Western blot檢測其在293T細胞中的表達強度。結果PCR結果顯示RegⅣ在PANC-1中表達最高,在BxPC-3中表達最低。測序驗證pGC-shRNA-RegⅣ重組質粒構建成功。將重組質粒穩定轉染入胰腺癌細胞株PANC-1后能明顯抑制RegⅣ mRNA 表達水平。過表達載體pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后進行Western blot鑒定,驗證pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ過表達載體構建成功。過表達RegⅣ基因轉染BxPC-3后,與空質粒組相比,RegⅣ表達量明顯提高。結論成功建立了靶向穩定干擾RegⅣ基因表達的shRNA胰腺癌細胞株PANC-1。

【關鍵詞】胰腺癌;再生基因4;慢病毒;短發夾干擾RNA

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81472578) and Science and Technology Commission of Shanghai Municipality,China (11JC1410000).

胰腺癌是一種病情進展快、早期診斷困難、早期易轉移、惡性程度高的疾病,其發病率幾乎等同于死亡率并且呈上升趨勢。胰腺癌的平均生存時間小于6個月,5年生存率小于5%,死亡率高居癌癥死亡率的第4～5位[1]。如此差的預后歸因于其早期易轉移的特性。因此,針對胰腺癌侵襲轉移的分子機制的研究是一項重要的基礎性工作。

Reg家族屬鈣依賴植物血凝素超家族,該家族屬于分泌型蛋白,具有急性期反應、凝集素和抗凋亡及促進生長作用,在G1期增殖和分化中起重要作用,共有4個成員:RegⅠ、RegⅡ、RegⅢ及RegⅣ。近年來在人群、動物模型及細胞家系的研究中發現,RegⅣ在多種胃腸道腫瘤具有特異性表達,某些對腫瘤的轉歸起到關鍵作用,如RegⅣ能提高胃癌的腹腔轉移率,有助于早期胃癌及腹腔轉移的臨床診斷,在胃癌細胞中高表達RegⅣ后能顯著影響細胞株對5-Fu的敏感性,說明RegⅣ可能抑制某些抑癌藥的效果[2-3];大腸癌患者復發后肝轉移病例的RegⅣ陽性率明顯高于無肝轉移的病例,RegⅣ高表達患者的生存率明顯低于低表達的患者,提示血清RegⅣ可能會預測CRC肝轉移的發生[4-5],RegⅣ還與大腸癌的TNM分期、淋巴結轉移相關,并且增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[6]。

在RegⅣ的機制研究中發現,RegⅣ能將胞外信號傳遞給EGFR和AKT，增加了AP-1轉錄因子活性,從而導致下游效應的放大,因此RegⅣ可能作為EGFR/Akt/AP-1信號通路的激活劑參與了腫瘤的發生與發展[7]。我們之前的胰腺癌研究中發現RegⅣ是Hedgehog信號通路中轉錄因子Gli1的靶基因,起到信號傳遞作用,最終起到影響腫瘤細胞的生物學效應[8]。

RegⅣ是再生基因家族 (regenerating gene family)最新發現的成員,是目前Reg家族中最短小的一個,有6個外顯子和5個內含子,編碼158個氨基酸的蛋白質,基因定位于染色體1p12～13.1,其17 000的蛋白產物在消化系統的上皮層特異性地表達,在胃腸道細胞的增殖分化過程中發揮重要作用,并同消化系腫瘤的惡性程度、轉移和抗藥性有關。RegⅣ在胰腺癌的杯狀囊泡狀結構中或腫瘤細胞胞漿中表達,其在胰腺癌組織以及胰腺上皮內瘤變3期 (PanIN3)標本及胰腺癌患者血清中均呈高表達[9-10]。重組RegⅣ蛋白能呈劑量依賴性促進胰腺癌細胞生長,其促生長效應可能通過PKB/AKT信號通路介導,而RegⅣ的單克隆抗體能抑制胰腺癌細胞的生長[9-10]。RegⅣ在胰腺癌中的高表達與腫瘤的侵襲轉移密切相關,高表達RegⅣ的胰腺癌細胞呈現抵抗化療及放療的作用,且更易于發生局部復發[11]。我們還證實RegⅣ是Hedgehog信號通路下游靶基因[11]，參與胰腺癌的發生發展。為了更好地研究RegⅣ基因在胰腺癌發病、轉移中的作用機制,并為后續的基因治療提供理論基礎,本實驗成功設計了針對RegⅣ基因的shRNA序列,構建了過表達載體,并成功構建了低表達RegⅣ基因的胰腺癌細胞株PANC-1。

材 料 和 方 法

材料PCR 引物、雙鏈脫氧核糖核酸Oligo (上海吉凱基因技術有限公司合成),慢病毒載體系統 (上海吉凱基因技術有限公司)包括3種質粒(pGCSIL-GFP載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體),其中pGCSIL-GFP載體含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及WRE等輔助元件,同時含有GFP基因,pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包裝所需的元件。慢病毒的包裝細胞293T 細胞株 (中國科學院上海生物所細胞庫),胰腺癌細胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990 均由上海市第十人民醫院消化內科保留。限制性內切酶、T4DNA 連接酶 (英國New England Biolabs公司),DMEM培養基,胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS，美國Gibco公司)、胰蛋白酶 (美國Invitrogen公司),大量質粒提取試劑盒 (德國Qiagen公司),Lipofectamine2000 (美國Invitrogen公司)。

方法

RT-PCR、Western blot法檢測各胰腺癌細胞株RegⅣ的表達按照Trizol試劑盒說明提取5種胰腺癌細胞株 (AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990)總RNA,RT-PCR引物 (上海英駿生物技術有限公司合成)通過Primer 5.0 軟件設計。RegⅣ上游引物:5′-CGCTGAGATGAACCCC-AAG-3′,下游引物:5′-TGAGAGGGAAGTGGGA-AGAG-3′,擴增長度145 bp;β-actin上游引物:5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′,下游引物:5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′,擴增長度為145 bp；循環參數制定為95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、進行40個循環后采用2-ΔΔCt進行分析。

常規提取細胞總蛋白,利用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品,以12%SDS-PAGE凝膠電泳后,轉移至PVDF膜,脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗 (1∶100)4 ℃孵育過夜,加入二抗 (1∶500)孵育1 h,洗膜后,以化學發光液顯像,暗室中進行X光片壓片、顯影、定影后得到目的蛋白表達變化條帶。取重復3次實驗后的平均值作為實驗結果。

RegⅣ-shRNA慢病毒表達載體的構建RegⅣ (NM_001159352.1)的基因信息來自GenBank,siRNA靶位點的尋找從RegⅣ開放閱讀框起始密碼子“ATG” 開始,在其下游75至100堿基位置后選取“AA”二連序列后的21個堿基序列。siRNA的設計優先選擇GC含量在40%～55%之間的靶基因序列,為了排除同源序列,確定特異性序列,需要將選擇的序列與在Gen-Bank中檢索獲得的基因組數據庫信息進行比較。設計4對小干擾RNA序列 (表1)。為了使寡核苷酸形成發夾結構,在每一單鏈內21nt的寡核苷酸以正反向組合,中間添加loop結構。在shRNA 3′端和5′端分別引入AgeI和EcoR I酶切位點,終止信號TTTTT連接在反義片段后從而終止轉錄,使后續克隆與鑒定更加方便。取等摩爾量的寡核苷酸干擾片段正負鏈,將其溶于退火緩沖液中,溫度為90 ℃水浴中放置15 min,待其緩慢降至室溫,即可獲得具有EcoR I和AgeI酶切位點的雙鏈DNA。將上面獲得的雙鏈DNA和pGCSIL-GFP載體進行連接,即可獲得PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒載體,分別命名為shRNA-RegⅣ-1、shRNA-RegⅣ-2、shRNA-RegⅣ-3、shRNA-RegⅣ-4。將上述4種載體轉化到DH5α大腸埃希菌感受態細胞中,搖菌后接種到LB瓊脂培養[(含Amp抗性 (100 μg/mL)]上在37 ℃恒溫條件下培養16 h,然后將生長的單菌落群進行基因測序以及PCR檢測。

RegⅣ基因過表達載體的構建通過PCR的方法從cDNA文庫中獲取目的基因,上述產物與pEGFP-RegⅣ-3FLAG過表達質粒載體分別進行XhoI、kpnI雙酶切,定向交換后通過電泳回收的雙酶切產物,然后轉化細菌感受態細胞并且進行測序驗證,正確后需要Western blot進一步檢測該質粒在293T細胞中的表達強度。

慢病毒顆粒的包裝和滴度測定首先使用10% FBS的DMEM培養基培養293T細胞,然后選擇干擾最明顯的shRNA與載體質粒pHelper 1.0及pHelper 2.0以及重組慢病毒載體PGC-shRNA-RegⅣ共同轉染293T細胞,培養8 h和48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達,觀察是否有明顯的綠色熒光,然后收集細胞上清液,其中含慢病毒顆粒。選取96孔板,每孔鋪4×104個293T細胞,總體積為100 μL。分別加入90 μL的無血清DMEM培養基于無菌的Ep管中,數量7～10個,其根據為病毒的預期滴度。將待測定的病毒原液10 μL加入到第1個Ep管中混勻,取其中的10 μL加入到第2個Ep管中,以此類推直到最后一管。選擇需要的細胞孔,丟棄其90 μL培養基,補充90 μL稀釋后的病毒溶液培養24 h,再補充100 μL的完全培養基,在熒光顯微鏡下觀察,計數熒光細胞比例在10%左右的孔中熒光細胞的數量。根據滴度計算公式:熒光細胞數×相應稀釋倍數,即可計算出病毒原液的滴度值,單位為 (TU)/mL[9]。

穩定表達PGC-shRNA-RegⅣ人胰腺癌細胞株PANC-1的感染與篩選選取6孔板,將PANC-1細胞分別鋪入6孔板中培養,共設3組,分別為:PGC-shRNA-RegⅣ實驗組、空白對照組以及空載體組。轉染液的配制:50 μL的OPTI-DMEM與2 μL Lipofectamine 2000 混和為A液,50 μL OPTI-DMEM與1 μL PGC-shRNA-RegⅣ混合為B液,將A液與B液混合后即獲得轉染液。將上述轉染液室溫放置20 min混勻,加入6孔板中,培養箱中培養6 h,棄去轉染液,換無抗生素的含10%FBS的DMEM完全培養基繼續培養48 h,在熒光顯微鏡下觀察慢病毒RNAi質粒上GFP的表達 (綠色熒光),觀察到至少80%以上的熒光表達。然后即可進行篩選,將6孔板中得培養基換為含殺稻瘟菌素 (1.25μg/mL)的選擇性培養基,培養2周后觀察是否有含抗體的細胞長出。若有細胞長出,則繼續傳代培養即可獲得穩定表達的細胞株。

熒光定量PCR以及Western blot法共同檢測穩定干擾后RegⅣ的表達為檢測RegⅣ在各種細胞中的表達情況,選取3種細胞,分別為:PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒穩定轉染細胞、轉染空質粒的細胞、未轉染的細胞。分別提取總RNA,使用紫外分光光度儀進行RNA定量,分別取2 μg RNA并逆轉錄成cDNA,然后用RT-PCR檢測含量 (RT-PCR擴增條件設置:95 ℃ 35 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環)。RegⅣ及內參基因引物同前。結果采用2-ΔΔCt進行分析 (ACt=待測基因Ct值-內參基因Ct值,-AACt=對照組平均Act-樣本Act,2-AAc代表基因相對對照組的表達倍數)。重復3次后取其平均值。

結果

RegⅣ在各種胰腺癌細胞中的表達RT-PCR結果顯示,RegⅣ在PANC-1中的mRNA水平在5株胰腺癌細胞中表達最高,而BxPC-3表達量最低。在Westernblot實驗中也得到同樣的數據。選擇PANC-1和BxPC-3細胞株進行后續實驗 (圖1)。

PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒載體的PCR電泳及測序鑒定將表達RegⅣ基因的shRNA片段與載體連接后進行PCR電泳,回收電泳中重組陽性克隆,進行測序 (由上海生工完成),其測序結果顯示:4組重組的RNA干擾慢病毒載體與設計合成的靶向鏈是一致的 (圖2)。證實shRNA慢病毒干擾載體已成功構建。

DNA were collected from 5 pancreatic cancer cell lines,and relativeRegⅣ mRNA expression were detected by qRT-PCR.All results were normalized to β-actin mRNA.Expression ofRegⅣ proteins in 5 pancreatic cancer cell lines were detected by Western blot analysis on cell extracts,using anti-RegⅣ antibodies.Expression ofRegⅣ is the highest in PANC-1 cell line both in mRNA level and protein level.

圖1RegⅣ基因在胰腺癌細胞株中的表達情況

Fig 1The expression ofRegⅣ in

pancreatic cancer cell lines

RegⅣ基因的過表達載體的鑒定成功合成過表達載體pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ后,首先進行Western blot測試,在蛋白水平上進行鑒定 (圖3)。圖3中泳道1為WB標準品 (48 000),帶FLAG標簽,以及融合GFP基因;泳道2為空載的293T細胞樣品,無表達;泳道3為過表達質粒轉染293T后的樣品,其中插入的基因片段為477 bp。對3種樣品進行Western blot檢測,結果顯示在45 000處有條特征帶。

慢病毒載體包裝及其滴度測定將RegⅣ-1干擾序列質粒與慢病毒包裝系統質粒同時轉染293T細胞 (圖4),在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數量,將熒光細胞比例在10%左右的孔選擇出來,計數熒光細胞個數。病毒原液的滴度值=以上計數×相應的稀釋倍數,本實驗的測定結果為2.3×108TU/mL,說明病毒已經包裝成功,已經有大量質粒成功轉入293T細胞。

RegⅣ基因的干擾效率檢測使用凝膠圖像處理系統對各個慢病毒載體構建的穩定轉染胰腺癌細胞株的RegⅣ表達情況進行Western blot分析,結果顯示其RegⅣ表達量分別為:共轉染空質粒組為95.63%±1.38%;RegⅣ-1干擾序列組為81.77%±1.82%,RegⅣ-2干擾序列組為13.53%±1.76%,RegⅣ-3干擾序列組為60.43%±0.87%,RegⅣ-4干 擾序列組為23.80%±3.06%,RegⅣ-1、RegⅣ-2、RegⅣ-3、RegⅣ-4干擾序列組與空質粒組比差異均有統計學意義 (P<0.05),其中RegⅣ-1干擾效果最明顯,在mRNA水平中得到同樣的結果。可見RegⅣ-shRNA可明顯抑制RegⅣ基因在胰腺癌PANC-1細胞中的表達 (圖5)。

The sequence of positive recombinant colons products is the same as that of sequences of primers showed in Tab 1.

圖2重組陽性克隆的測序結果

Fig 2The result of sequence analysis of positive recombinant colons products

1:Standard control; 2:293T cell without transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ;3:293T cell transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ.

圖3重組過表達質粒pEGFP-N1-3FLAG-

RegⅣ Western blot鑒定

Fig 3Recombinant over-expression virus vector pEGFP-

N1-3FLAG-RegⅣ tested by Western blot

A:Phase image×100;B:Fluorescence image× 100.

圖4重組慢病毒轉染后熒光圖

Fig 4Fluorescence microscope image after transfected

with recombinant virus vector

過表達RegⅣ基因的效率檢測采用2-△△Ct法分析比較過表達RegⅣ基因轉染BxPC-3細胞株后RegⅣ的相對表達。結果顯示:在與親本對照組相比較時,空質粒組RegⅣ mRNA相對表達水平無明顯變化,過表達組相對RegⅣ表達量為339.00%±13.26% (圖6)。

討論

RNAi技術包括小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),小發夾RNA (short hairpin RNA，shRNA),雙鏈RNA (double-stranded RNA,dsRNA),微小RNA (microRNAs,miRNA)等。shRNA是具有緊密發夾環的一段RNA序列,發夾結構是由兩個短反向重復序列與一個莖環 (loop)序列位組成,莖環結構的作用是分隔兩個序列,后附以TTTTT為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。載體中的啟動子可以確保shRNA的表達,然后利用載體把shRNA導入細胞,此載體可以與shRNA一起傳遞到子代細胞中去,使子代細胞的基因也被沉默,從而得以形成穩定持續的轉染效果。RNA誘導沉默復合物 (RNA-induced silencing complex,RISC)可以結合siRNA,此siRNA來源為被細胞機制切割的shRNA的發卡結構,這些發卡結構可以降解目的基因mRNAs而發揮RNA干擾效應。常用的病毒表達載體包括逆轉錄病毒、腺病毒和慢病毒等,具有特異、高效的轉染效率,RNAi效應高,抑制作用穩定持續。但是逆轉錄病毒與腺病毒載體系統也都有一定的弊端,如腺病毒載體在實現體內長期穩定表達方面能力不足,并且在多次使用會引起免疫反應[12];而逆轉錄病毒載體的不足主要表現在當其應用于主要處于靜止期的細胞時,其長期表達的特點就難以體現[13],并具有免疫原性和致瘤性問題[14]。本組采用的慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-1),是攜帶干擾RNA的理想載體,其優勢在于相對較低的免疫原性和細胞毒性,當其整合到宿主細胞時,可以使得目的基因穩定表達,另外不可忽視的優點在于,其感染效率很高,對于大片段的外源性目的基因包容性較強[15]。

本研究設計的4對干擾靶序列來源是依據PubMed Home所提供的RegⅣ的基因信息,再經過載體連并且隨后轉化到感受態細胞中后,進行陽性克隆的篩選,測序鑒定結果顯示與設計的序列相一致,說明本實驗成功構建了4對shRNA-RegⅣ慢病毒載體。本實驗隨后又將shRNA-RegⅣ慢病毒載體和已經表達目的基因的克隆質粒同時轉染293T細胞,并用Western blot進行了蛋白水平的檢測,結果發現所構建的載體對目的基因的敲減作用很顯著。經過一系列的慢病毒包裝以及滴度檢測,使得重組慢病毒載體感染細胞的效率較高。當目的基因進入細胞后,經過反轉錄從而整合到基因組中對RegⅣ產生了持續、高效、特異的抑制,為了使后期研究更具有說服力,我們還成功構建了RegⅣ過表達載體,奠定了后期對RegⅣ在胰腺癌發生發展中的分子機制和動物實驗的研究基礎。

1:PANC-1 transfected with empty vector control; 2:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ1;3:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ2; 4:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ3; 5:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ4.

圖5RT-PCR及Western blot法檢測PANC-1細胞中

RegⅣ基因的表達

Fig 5Expression ofRegⅣ mRNA and proteins were detected

by Western blot and RT-PCR in PANC-1 cell lines

1:BxPC-3; 2:BxPC-3 transfected with empty vector control; 3:BxPC-3 transfected with over-expression vectorRegⅣ.

圖6RT-PCR檢測RegⅣmRNA在3組細胞中的表達情況

Fig 6Expression ofRegⅣ mRNA in three groups by RT-PCR

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Establishment of pancreatic cancer cells with stable interference by lentivirus shRNA targetingRegⅣ gene

LI Jian1, HU Qi-li1, XU Ling2,3, WEI Wei4, ZHAO Yan2, LIU Hua2, TANG Mao-chun2,SONG Zhen-shun1, XIA Xiao-jun2, WANG Xing-peng2,5, WANG Feng2△

(1DepartmentofGeneralSurgery,2DepartmentofGastroenterology,4DepartmentofEmergency,ShanghaiTenthPeople’sHospital，TongjiUniversity,Shanghai200072,China;3DepartmentofGastroenterology,TongRenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China;5DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct siRNA expression and overexpression vector targeting RegⅣ gene and establish the pancreatic cancer cells PANC-1 with stable inhibition or stable over-expression of RegⅣ gene.MethodsRegⅣ gene expression were examined in several pancreatic cancer cell lines by real-time PCR.The recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector and pEGFP-N1-3FLAG-Reg Ⅳ vector were constructed,and then transfected into pancreatic cancer cells by Lipofectamine2000.After pancreatic cancer cells with constant expression of the pGC-shRNA-RegⅣ were established,the interference efficiency of RegⅣ mRNA expression was detected by real-time PCR.ResultsThere was highest expression of RegⅣ gene in the pancreatic cancer cell line PANC-1 and lowest expression in BxPC-3.Recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector was successfully constructed by the identification of sequencing.The recombinant vector markedly inhibited RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line PANC-1.Recombinant lentivirus pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ vector was successfully constructed by sequencing and Western blot, which markedly increased RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line BxPC-3. ConclusionsRecombinant lentivirus vector pGC-shRNA-RegⅣ and overexpression vector pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ targeting RegⅣ gene was successfully constructed and pancreatic cancer cell line PANC-1 with stable siRNA expression targeting RegⅣ gene and BxPC-3 with stable over-expression were established.

【Key words】pancreatic cancer;regenerating islet-derived family member 4 gene;lentivirus vector;short hairpin RNA

(收稿日期:2015-09-06;編輯:王蔚)

【中圖分類號】R576

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.004

國家自然科學基金(81472578);上海市科學技術委員會基金(11JC1410000)

△Corresponding authorE-mail:wolffeng2000@hotmail.com