環介導等溫擴增技術早期診斷結核性腦膜炎的研究

孫雯雯 肖和平

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·論著·

環介導等溫擴增技術早期診斷結核性腦膜炎的研究

孫雯雯 肖和平

目的 評價環介導等溫擴增(LAMP)技術快速檢測腦脊液標本中結核分枝桿菌對于結核性腦膜炎(TBM)早期診斷的價值。 方法 收集上海市肺科醫院于2014年1月至2015年12月收治的200例疑診為TBM的患者在行抗結核藥物治療前的腦脊液標本，分別采用結核分枝桿菌涂片法(簡稱“涂片法”)、BACTECTMMGIT液體960培養法(簡稱“MGIT 960培養法”)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RTFQ PCR)法和LAMP技術檢測腦脊液標本中結核分枝桿菌。使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計算LAMP技術診斷TBM的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值； 4種檢測方法陽性檢出率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義；LAMP技術與其他3種檢測方法檢測的一致性評價采用Kappa檢驗。結果 200例患者中臨床確診為結核性腦膜炎者172例(86.00%)，4種檢測方法(涂片法、MGIT 960培養法、LAMP法，RTFQ PCR)對診斷結核性腦膜炎的敏感度分別為2.91%(5/172)、12.79%(22/172)、43.02%(74/172)、34.30%(59/172)。LAMP法與涂片法、MGIT960培養法比較，敏感度均明顯增高，差異有統計學意義(χ2=75.11，P=0.000；χ2=43.88，P=0.002)；與RTFQ PCR法比較，敏感度差異無統計學意義(χ2=2.08，P=0.130)。LAMP技術對診斷結核性腦膜炎的特異度分別為92.86%(26/28)，其他3種檢測方法均為100.00%(28/28)。LAMP技術與RTFQ PCR、MGIT 960培養法、涂片法檢測結核性腦膜炎一致性總體符合率與Kappa系數分別為88.50%(177/200)、0.87；71.00%(142/200)、0.73；63.50%(127/200)、0.59。結論 LAMP 技術在診斷結核性腦膜炎患者中具有較高的敏感度、特異度，與MGIT960培養法及RTFQ PCR法具有較高的一致性，對于結核性腦膜炎的早期診斷具有一定的臨床價值。

結核, 腦膜； 診斷； 實驗室技術和方法； 核酸擴增技術； 對比研究

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)患者臨床表現缺乏特異性,病原學陽性檢出率極低，國內報道腦脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)結核分枝桿菌(MTB)檢出率僅為12.3%[1]。TBM患者的CSF改變多不典型，易與新型隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎等相混淆,故早期診斷存在困難。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術檢測結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)是一種新型的核酸擴增方法，該方法無需昂貴的設備和嚴格的實驗室環境條件，具有方法簡單、反應快速靈敏等優點。目前，國內外已有研究者做了一些有益的探索[2]，但應用LAMP技術檢測CSF中結核分枝桿菌的研究極為少見，于霞等[3]在采用LAMP技術檢測臨床標本結核分枝桿菌的系統評價中指出，納入全球18項研究中17項為痰標本，因此臨床上針對LAMP技術在CSF結核分枝桿菌檢測方面的應用價值缺乏較大樣本量的研究。本研究收集200例上海市肺科醫院于2014年1月至2015年12月收治的疑診為結核性腦膜炎患者在行抗結核藥物治療前的CSF標本，分別采用結核分枝桿菌抗酸染色涂片法(簡稱“涂片法”)、BACTECTMMGIT 960液體培養法(簡稱“MGIT 960培養法”)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ PCR)、LAMP法檢測標本中結核分枝桿菌，對所得結果進行統計學分析，以評價LAMP技術對結核性腦膜炎早期診斷的價值。

資料和方法

一、一般資料

選取上海市肺科醫院于2014年1月至2015年12月收治的疑診為結核性腦膜炎并擬行抗結核藥物治療的患者200例。根據診斷標準、排除標準最終臨床確診為結核性腦膜炎患者(簡稱“TBM組”)172例，其中男108例(62.79%)，女64例(37.21%)，年齡16～78歲，平均年齡為(38.6±22.8)歲；排除結核性腦膜炎的患者(簡稱“非TBM組”)28例，其中男19例(67.86%)，女9例(32.14%)，年齡為21～76歲，平均年齡為(42.8±24.5)歲。28例非TBM組患者中，16例為病毒性腦膜炎、6例為細菌性腦膜炎、4例為隱球菌腦膜炎、2例為肺癌腦轉移。收集患者抗結核藥物治療前的腦脊液標本，保存于-20 ℃冰箱內直至統一檢測。經醫院倫理委員會同意，所以患者均簽署用于本次臨床試驗采取標本的知情同意書。

二、參照標準

結核性腦膜炎的診斷建立根據2010年國際TBM協作組制定的診斷標準[4]，評分標準見表1。

1.臨床疑診標準為包含以下1個或多個癥狀或體征：發熱、頭痛、嘔吐、易激惹、腦膜刺激征、抽搐、局灶性神經損害、意識狀態改變或嗜睡。

2.結核性腦膜炎診斷標準和排除標準：(1)確診結核性腦膜炎須符合以下標準之一：①臨床入選標準+CSF抗酸染色陽性，或CSF結核分枝桿菌培養陽性，或CSF核酸擴增實驗陽性；②腦(脊髓或腦膜)組織的抗酸染色陽性，且符合結核病病理變化 (多見于尸檢中)。(2)很可能的結核性腦膜炎：臨床入選標準+診斷評分10分(無影像學資料)或12分(有影像學資料)+排除診斷,其中至少有2分來自腦脊液檢測或腦影像學評分。(3)可能的結核性腦膜炎：臨床入選標準+診斷評分9分(無影像學資料)或6～11分(有影像學資料)+排除診斷，如未行腰椎穿刺術或頭顱正電子發射計算機體層攝影術(PET)不能做此診斷。所有入組患者均經過規范抗結核藥物治療4～8周，并根據臨床癥狀改善情況復查腦脊液、影像學等檢查，并以此資料建立臨床診斷，對疑診患者抗結核藥物治療無效者均行進一步檢查明確診斷。

三、檢測方法

1．結核分枝桿菌抗酸染色涂片法：收集1 ml腦脊液標本進行涂片，干燥后行抗酸染色，鏡檢查找抗酸桿菌。操作嚴格按照《結核病實驗室診斷檢驗規程》[5]和試劑說明書進行操作。

2. MGIT 960液體培養：收集經4% NaOH溶液處理的腦脊液標本1 ml，取0.1 ml接種于酸性羅氏培養基(珠海貝索生物技術有限公司產品)斜面上, 每份標本分別接種2支, 置37 ℃培養箱培養4～8周，記錄培養結果。MGIT 960液體培養系統由美國 BD 公司生產。將腦脊液標本按照 BACTECTMMGIT生產規范(MGITTMProcedure Manual)要求進行培養[6]。

表1 結核性腦膜炎的臨床診斷和排除診斷

3．DNA提取與LAMP技術檢測：收集1.5 ml腦脊液進行結核分枝桿菌DNA提取與LAMP技術檢測。針對結核分枝桿菌特異靶基因序列IS6110設計引物(所用引物)如下：

F3 5′-AGACCTCACCTATGTGTCGA-3′；B3 5′-TCGCTGAACCGGATCGA-3′；FIP 5′-ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAGCCTACGTGGCCTTTGTCAC-3′；BIP 5′-AAGCCATCTGGACCCGCCAACCCCTATCGTATGGTG-GAT-3′；FLP 5′-AGGATCCTGCGAGCGTAG-3′； BLP 5′-AAGAAGGCGTACTCGACCTG-3′。

(1)DNA提取：采用核酸快速提取試劑盒[榮研生物科技(中國)有限公司]，該試劑盒通過對樣本中所含的結核分枝桿菌進行破碎處理，使細菌內所含的核酸游離到溶液中，并將得到的溶液與吸附劑試劑管中的多孔介質混合，把樣本中所含的阻礙核酸擴增反應的物質去除，在通過滴注蓋薄膜濾器，使核酸溶液被提取出來。操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。(2)LAMP擴增：采用達安基因股份有限公司生產的結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒。將30 μl的核酸溶液加到反應試管中。將恒溫器在67 ℃加熱40 min，再用加熱器進行酶的滅活，80 ℃，5 min。反應結束后將反應管上下甩動數次,使反應液中的擴增產物與預先包被在試管內壁的SYBR Green I染料混合，置于紫外線燈管下照射，陽性管發出綠色熒光，未發出熒光為陰性。操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

4．RTFQ PCR法：采用達安基因股份有限公司生產的結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒，實時熒光核酸擴增儀(型號DA7600)，按試劑盒方法進行檢測。

四、相關定義

(1)敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；(2)特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；(3)陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；(4)陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。

五、統計學分析

采用SPSS 17.0軟件將所有患者基礎信息和實驗室檢測結果建立數據庫。所有患者隨訪至少6個月，動態記錄臨床癥狀及體征、腦脊液檢測指標、影像學表現、治療后轉歸，建立最終的臨床診斷。根據2010國際TBM協作組制定的診斷標準[4]，選擇符合確診標準患者的CSF標本。使用SPSS 17.0軟件進行數據的統計學分析，計算LAMP法診斷結核性腦膜炎的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。對不同方法檢出率的比較使用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義；進行LAMP法與其他3種檢測方法的一致性檢驗，計算Kappa系數。Kappa系數取值在-1～+1，其值越大，說明一致性越高，Kappa系數在0.3～0.7提示一致性較好，Kappa系數>0.7說明一致性強。

結 果

一、 4種檢測方法的檢出情況

在最終確診為結核性腦膜炎的172例患者中，4種檢測方法(涂片法、MGIT 960液體培養法、LAMP法，RTFQ PCR法)陽性檢出率分別為2.91%(5/172)、12.79%(22/172)、43.02%(74/172)、34.30%(59/172)。檢出時間(中位數)結果說明，LAMP法的檢出時間最短(表2)。

二、 4種檢測方法檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值

本研究的200例患者中，LAMP診斷結核性腦膜炎的敏感度為43.02%(74/172)、特異度為92.86%(26/28)、陽性預測值為97.37%(74/76)、陰性預測值為20.97%(26/124)；LAMP法與涂片法、MGIT 960培養法相比，敏感度明顯增高，差異有統計學意義(χ2=75.11，P=0.000；χ2=43.88，P=0.002)；與RTFQ PCR法相比，敏感度的差異無統計學意義(χ2=2.08，P=0.130)。具體見表3。

三、LAMP與其他3種方法檢測結果比較

以RTFQ PCR陽性為標準，PCR陽性者LAMP的敏感度為94.92%(56/59)，PCR陰性者LAMP的特異度為85.82%(121/141)。2種方法具有較強的一致性符合率88.50%(177/200)，Kappa系數為0.87；以BACTEC MGIT 960培養法陽性為金標準，培養陽性者LAMP的敏感度為90.91%(20/22)，培養陰性者LAMP的特異度為68.54%(122/178)，2種方法的一致性符合率為71.00% (142/200)，Kappa系數為0.73；以涂片法為標準，涂片陽性者LAMP的敏感度為80.00%(4/5)，涂片陰性者LAMP的特異度為65.08%(123/195)，兩者一致性符合率為63.5%(127/200)，Kappa系數為 0.59(表4)。

表2 不同檢測方法檢測TBM及非TBM患者的結果分析

表3 4種方法診斷結核性腦膜炎的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表4 其他3種方法檢測結果與LAMP檢測結果的比較

討 論

結核病已成為全世界范圍內危害人類生命安全的主要傳染性疾病之一，并位列感染性疾病死因第二名[7]。TBM是結核分枝桿菌感染后經血行播散種植于腦膜和軟腦膜，進而侵入蛛網膜下隙引起腦血管或腦實質病變的中樞神經系統感染性疾病。但部分患者發病隱匿，臨床表現不典型，其危害比較嚴重，預后差。因此，提高TBM的早期診斷已經成為目前TBM診療環節中急需解決的臨床問題之一。據最新國際TBM診斷標準[4]，指出CSF中鏡檢查到抗酸桿菌、分離培養法或RTFQ PCR法檢測到MTB均可作為臨床確診TBM的標準，但由于腦脊液標本中MTB荷菌量低，涂片法檢測的敏感度低、特異度差，不能區別死菌或活菌，而培養法檢測雖精確可靠，但所需時間較長，極易錯失最佳的治療時期[8]。所以，目前TBM的臨床診斷主要依賴于對患者的臨床表現、腦脊液檢查、影像學檢查及對治療效果的綜合判斷[9]；但由于近年來抗生素和糖皮質激素的不規范使用，使一些TBM患者在未得到規范的抗結核藥物治療前病情就得到了暫時的緩解[10]，干擾了對結核病的診斷。因此，筆者認為探索如何在TBM早期診斷中提高早期病原學診斷效率具有極大意義。

MGIT 960培養法是近年研制的專門用于MTB快速培養的方法，主要通過連續檢測接種標本培養基所顯示的熒光強度變化來判斷是否有分枝桿菌生長，平均檢出時間明顯縮短，平均為2～4周，目前已成為臨床上最有效的結核病病原學確診方法之一[5]，是細菌學培養檢測的主要發展方向[11]。本研究中，MGIT 960培養法診斷TBM的敏感度僅為12.79%(22/172)，雖遠遠高于常規涂片法[2.91%(5/172)]，但顯然無法滿足臨床需求。

PCR技術是通過對基因的選擇性片段進行體外高效擴增，實現目的基因的檢測，是目前臨床上廣泛應用于結核病病原學診斷的分子生物學技術；而RTFQ PCR法是在PCR技術的基礎上，加入熒光標記的探針，把核酸擴增、雜交及光譜技術結合在一起，從而提高檢測的敏感度和特異度。目前，RTFQ PCR法已成功用于檢測痰標本和肺泡灌洗液標本，特別是含菌量較低的標本。已有研究顯示，RTFQ PCR法檢測腦脊液中的結核分枝桿菌具有較高的敏感度(68%，95%CI=62%～74%)與特異度(100%)[12]，因此本研究選取RTFQ PCR法作為檢測手段之一，并與LAMP法進行對照研究。

2000年，Notomi等[13]開發出一種新的DNA擴增技術-LAMP，之后Nagamine等[14]的研究也表明，通過設計兩條環形引物可使反應速度提升1/2～1/3，其技術特點為：(1)儀器簡便：擴增反應在恒定溫度下就能進行，不需要PCR儀和其他檢測儀器，僅水浴鍋即能完成反應。(2)高特異性：針對靶基因的6個區段，設計4條引物。若有一條引物不匹配，則不能進行反應。(3)快速、高效擴增：整個擴增過程在60 min內即可完成。(4) 敏感度高：最低檢測值為1～10拷貝，比PCR最低檢測值高2～3個數量級。(5)步驟簡單：所有試劑在反應前加入即可，實現一步法核酸擴增。(6)鑒定簡便：目測即可判斷是否發生了反應。即使沒有分子生物學基礎的檢驗人員在經過1周培訓后也能掌握該技術[15]。

目前，LAMP法對MTB的檢測主要是針對MTBC靶基因gyrb和IS6110[16-17]，本研究基于IS6110設計引物，利用LAMP技術對臨床疑診為TBM的患者CFS標本進行分析，最終發現LAMP法診斷TBM的敏感度為43.02%，明顯高于涂片法(2.91%)及MGIT 960快速培養法(12.79%)，差異均具有統計學意義(χ2=75.11，P=0.000；χ2=43.88，P=0.002)，且具有較高的特異度(92.86%)，證明LAMP法對于早期診斷TBM可能具有較高的臨床價值。Nagdev等[18]通過LAMP法檢測CFS標本，結果表明LAMP對TBM的診斷敏感度高達88.23%，特異度達80.00%，這是首次運用LAMP法檢測CFS中MTB的研究，但該研究樣本量較小，僅為27例；本研究結果中LAMP法對MTB的敏感度(43.02%)遠遠低于上述國外同類研究，這可能與我國是結核病高發的發展中國家，在臨床診治、流行病學研究、檢測技術條件上與發達國家存在較大差異有關；再則，LAMP技術應用于檢測CFS診斷 TBM的研究較少，本研究是全球第二次、國內首次，除可查尋文獻外，缺乏可借鑒資料，且操作人員檢測CFS經驗也較少，可能存在一定的實驗室誤差。以上原因可能導致了本研究與國外類似研究結果的差距。但本研究結果顯示，LAMP技術對TBM診斷具有較MTB涂片法、培養法更高的價值，與PCR法具有一致的臨床診斷價值，但成本更低廉，與國外研究[18]結論相一致。提示我們對LAMP技術有進一步深入研究的理由和空間。

近年來，已經出現了LAMP法檢測MTB技術的改進與創新，如將rimM(16SrRNA蛋白)作為靶目標設計為LAMP引物，使檢測方法的敏感度達到1 pg/μl基因組DNA[19]；將LAMP技術與其他技術結合在一起的方法(如逆轉錄環介導等溫擴增結合免疫吸附雜交技術)快速檢測體液標本MTB的16SrRNA，該方法可以重復檢測單一拷貝[20]，Ustar生物技術有限公司通過固定在塑料盒內的條帶側向流動檢測LAMP擴增產物，有效防止了擴增產物的泄漏[21]。這些研究將進一步有助于提高LAMP技術的準確性，有助于提高檢測的敏感度。

已有研究表明，LAMP法比PCR法的最低檢測濃度提高了10倍[22]，提示對于荷菌量更低的標本(如菌陰痰標本、CFS標本等)進行LAMP法檢測可能更具優勢。本研究中，將LAMP技術與RTFQ PCR法檢測結果相比較，兩者敏感度的差異無統計學意義 (χ2=2.08，P=0.130)，且具有較高的一致性符合率(88.50%)，Kappa系數為0.87。筆者認為RTFQ PCR法本身是PCR經過改良的技術，其敏感度較PCR檢測高，因此RTFQ PCR與LAMP技術敏感度相似。但RTFQ PCR法的檢測時間仍需5～6 h，且需要價格較為昂貴的設備；通過對擴增反應曲線圖譜來判讀結果，對操作人員的技術水平要求較高。而LAMP法具有檢測時間更短(1.2 h)、儀器更簡便、對檢測人員技術水平要求更低的優勢，更適合在發展中國家和基層廣泛開展。

本研究還發現一個現象，將LAMP法分別與MGIT 960培養法和RTFQ PCR法作對比，其敏感度明顯高于MGIT 960培養法(χ2=43.88，P=0.002)，但與RTFQ PCR法差異無統計學意義(χ2=2.08，P>0.05)，且在診斷的一致率方面，LAMP與RTFQ PCR法的一致性符合率(88.50%，Kappa=0.87)也高于與MGIT 960培養法的一致率(71.00%，Kappa=0.73)，其原因可能是由于RTFQ PCR法和LAMP法等分子生物學檢測法對活菌或死菌的檢測結果均為陽性，而常規培養法只有活菌才能培養陽性，這也提示臨床醫生在TBM治療轉歸的評價方面，LAMP等生物學檢測方法可能參考意義不大。

根據本研究結果，在LAMP法檢測陽性的標本中，最終排除TBM的患者有2例，提示本研究存在一定的假陽性率，這主要是LAMP技術反應的高敏感性極易使樣品與反應體系污染。如：在打開裝反應液的管蓋時, 反應產物容易形成氣溶膠污染環境、試劑和實驗器材，從而造成假陽性。因此,為了防止假陽性結果的出現，我們在LAMP 操作的整個過程中要謹慎小心, 提高實驗者的操作水平；將配制反應液的實驗區域和加入模板的實驗區域，以及觀察結果的實驗區域分開, 實行分區操作，注意防止樣品間的交叉污染，嚴格控制可能導致污染的機會。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

Exploration of loop-mediated isothermal amplification in early diagnosis of tuberculous meningitis

SUNWen-wen，XIAOHe-ping.

ClinicandResearchCenterofTuberculosis，ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis，ShanghaiPulmonaryHospital，TongjiUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200433，China

Correspondingauthor：XIAOHe-ping,Email：xiaoheping_sars@163.com

Objective To evaluate the LAMP assay for rapidly detection ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) in cerebrospinal fluid (CSF) and diagnose TBM in early stage. Methods The CSF samples were collected from patients who were clinical suspected tubercular meningitis before treatment from January 2014 to December 2015 in Shanghai pulmonary hospital. The CSF samples were tested by acid-fast bacillus (AFB) staining, BACTEC MGIT 960 culture, RTFQ PCR and LAMP. The clinic information and the final clinical diagnosis were recorded. Statistical analysis was done by SPSS 17.0，the sensitivity,specificity, positive predictive value (PPV),negative predictive va-lue (NPV) of the LAMP assay in the diagnosis of TBM were calculated; The sensitivity comparison among the four methods were performed using Chi-squared test，P<0.05 was considered statistically significant. The concordance between AFB, RTFQ PCR, BACTEC MGIT 960 cultureand and LAMP was evaluated byKappatest. Results A total of 200 CSF specimens were evaluated retrospectively using the LAMP assay,172 (86.00%) of them were diagnosed TBM finally. The sensitivity of the four methods (AFB staining, BACTEC MGIT 960 culture, RTFQ PCR and LAMP) were respectively: 2.91% (5/172),12.79% (22/172),43.02% (74/172),34.30% (59/172). The sensitivity of LAMP was significance higher than AFB and BACTEC MGIT 960 culture (χ2=75.11，P=0.000；χ2=43.88，P=0.002)；while no significant difference was found compared RTFQ PCR (χ2=2.08，P=0.130). The specificity of LAMP and other there methods for the diagnosis of TBM in this study were 92.86% (26/28) and 100.00%. The concordance of Lamp with BACTEC MGIT 960 culture and RTFQ PCR were 71.00% (142/200) and 88.50% (177/200)，theKappavalue were 0.73 and 0.87 respectively. Conclusion LAMP assay has a high sensibility and specificity in patients diagnosed TBM，the performance of LAMP was high consistency with RTFQ PCR and BACTEC MGIT 960 culture； LAMP could be a valuable method in early diagnosis of TBM.

Tuberculosis, meningeal; Diagnosis； Laboratory techniques and procedures； Nucleic acid amplification techniques； Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.12.018

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題(20134Y153)

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院結核病臨床研究中心 上海市結核病(肺)重點實驗室

肖和平，Email：xiaoheping_sars@163.com

2016-06-28)