連續縫合間斷打結吻合動脈在小鼠心臟移植中的應用

崔得利　譚長軍　劉　忠

(1大連醫科大學附屬第一醫院普外科　大連　116011;2復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所-上海市器官移植重點實驗室　上海　200032)

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連續縫合間斷打結吻合動脈在小鼠心臟移植中的應用

崔得利1▲譚長軍2▲劉忠1△

(1大連醫科大學附屬第一醫院普外科大連116011;2復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所-上海市器官移植重點實驗室上海200032)

【摘要】目的應用連續縫合間斷打結法吻合動脈建立小鼠心臟移植模型。方法近交系C57BL/6j( (H-2b))、BALB/c( (H-2d))小鼠各30只,建立小鼠腹部心臟移植模型 (C57BL/6j→BALB/c),連續縫合間斷打結法端側吻合供體升主動脈和受體腹主動脈;一針后壁先縫法連續吻合供體肺動脈和受體下腔靜脈。觀察移植心臟搏動持續時間及受體生存時間。結果手術成功率90%(27/30),總手術時間 (91.77±6.70)min,動脈吻合時間 (24.63±1.67)min,靜脈吻合時間 (15.17±1.80)min。供心中位存活時間8 天,病理組織學示典型排斥反應。結論應用連續縫合間斷打結法吻合動脈降低了小鼠心臟移植的手術難度,效果可靠,值得推廣。

【關鍵詞】小鼠;動物模型;心臟移植;動脈吻合

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81373874,81472218).

小鼠心臟移植模型是移植免疫學研究的重要工具[1],但建模要求高,動脈吻合是其中的難點[2],對于不具備顯微外科基礎的醫學生而言難度較大。受器官缺血時間限制,器官移植動物模型多采用連續縫合法重建血流。但我們在前期訓練中發現:應用經典的連續縫合法建立主動脈和腹主動脈端側吻合,開放血流后,大出血和吻合口狹窄發生率較高,是建模失敗的首要原因。有鑒于此,我們嘗試應用連續縫合間斷打結法改進動脈吻合,效果滿意,報告如下。

材 料 和 方 法

實驗動物選擇SPF級近交系雄性小鼠,C57BL/6j(H-2b)為供體(n=30),BALB/c(H-2d)為受體(n=30),體質量22～25 g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。于無菌通風25℃恒溫環境中飼養,術前不禁食、不禁水。

器械及試劑16倍手術顯微鏡 (上海醫療器械股份有限公司光學儀器廠),顯微鑷、顯微持針器、顯微剪 (上海金鐘醫療器械廠),手術剪 (上海醫療器械股份有限公司),11-0、8-0、5-0帶線縫合針(上海浦東金環公司),戊巴比妥鈉(美國Sigma公司,用生理鹽水稀釋成1%),肝素鈉注射液 (上海第一生化藥業有限公司,用生理鹽水配成50 IU/mL)。

手術方法

術前準備參考Corry等[3]的手術方法,建立小鼠腹部心臟移植模型。先受體后供體依次進行麻醉,均使用戊巴比妥鈉0.005 mL/g腹腔注射麻醉,并聯合乙醚輔助。

受體手術腹正中線剪開腹壁進腹,顯露腹主動脈及下腔靜脈。11-0線結扎睪丸動脈,8-0線集束結扎下腔靜脈屬支血管。在腎靜脈下方及髂血管分叉上方各穿1根5-0阻斷線,不打結,備用。

供體手術顯露下腔靜脈,從下腔靜脈注入冰肝素鹽水2 mL,完成供體肝素化。下腔靜脈放血后迅速剪開胸腔暴露心臟,冰鹽水紗布覆蓋心臟5-0線結扎上、下腔靜脈。離斷主動脈及肺動脈,集束結扎其余血管,剪取心臟放入冰鹽水中保存。

心臟移植阻斷線打活結阻斷腹主動脈及下腔靜脈。11-0縫合針穿過腹主動脈前壁,懸吊血管壁,彎顯微剪刀沿縫合針剪一橢圓形切口,同法在下腔靜脈開窗。從冰肝素鹽水中取出供心,置于受體腹部右側,冰鹽水紗布覆蓋。11-0線將供體升主動脈兩端分別與受體腹主動脈開口兩端 (12點及6點處)縫合,作為兩側錨定線。11-0線連續縫合腹主動脈左側壁至對側錨定線,共4針,縫合過程預留“線圈”,周長約1.3 cm,一側血管壁縫合結束后,從中間剪斷“線圈”,相應的線頭與線尾打結,打結時切忌上提血管以免誤入氣泡(圖1)。

A:Two opposing anchor sutures placed 180° apart;B:Running suture using open loop;C:The loop was cut in between;D:Suture was tied individually as interrupted method.

圖1連續縫合間斷打結法示意圖

Fig 1Schematic diagram of continuous-interrupted method

翻轉供心至對側,同法縫合動脈右側壁,縫合結束前肝素鹽水沖洗管腔,盡量剪短殘余尾線,以免影響靜脈左側壁吻合。靜脈吻合采用一針后壁先縫法[4]連續縫合肺動脈與下腔靜脈。吻合完畢后,開放血流,溫生理鹽水復溫,待復跳規則后復位腸管并關腹(圖2)。

術后處理與觀察術后25 w白熾燈照射15～30 min。每天觀察小鼠的活動情況并通過觸診判斷供心搏動情況,受體存活3天以上且心臟持續搏動則視為手術成功。術后未用抗生素及免疫抑制劑,術后第7天隨機取5只小鼠的移植心臟行病理組織學檢查,重點觀察心肌組織損傷及炎性細胞浸潤情況,依據2005年國際心肺移植協會(ISHLT)制定的心臟移植排斥反應標準[5]進行分級。

結果

心臟移植結果30例小鼠心臟移植手術的成功率為90%。總手術時間 (91.77±6.70) min,其中動脈吻合時間 (24.63±1.67) min,靜脈吻合時 間 (15.17±1.80) min。3例手術失敗,其中1例因麻醉意外死亡，2例因心臟流出道受阻,術后2 天內死亡,未出現心臟灌注不足或動脈狹窄等情況。供心中位存活時間為8天,供心停跳后,受體可長期生存。

A:Anastomosis was completed;B:After unclamping;C:Anastomotic sites of aorta and inferior vena cava;D:View before abdominal closure.

圖2吻合完畢示意圖

Fig 2Soheme of completed anastomosis

病理組織學檢查供心存在不同程度的炎性細胞浸潤,伴有心肌組織損傷,呈典型排斥反應,ISHLT分級為2R級(圖3)。

A and B:The myocardial area appeared inflammatory cells infiltration,accompanied by myocardial tissue damage in rejection combination after 7 days following surgery (A:100×,B:200×);C and D:The myocardial area was intact in naive C57BL/6j heart (C:100×,D:200×).

圖3心肌部位HE染色

Fig 3HE staining of mycardia

討論

由于器官移植受缺血時間的限制,小鼠心臟移植的動脈吻合多采用連續縫合法,其主要優點是操作簡便、快速。但我們在前期訓練中發現如下缺點:(1) 腹主動脈開窗口徑在端側吻合中難以控制[6]。如腹主動脈開窗口與供體的升主動脈完全匹配,在縫合兩端的錨定線后,兩側的血管邊緣緊貼在一起,造成血管腔難以顯露,尤其在最后1～2針時。若吻合口不匹配,在十分狹小的視野內連續縫合針距調整十分困難。(2) 血管吻合的空間和視野問題。在16倍顯微鏡下,若每次縫針后均拉緊縫線,則最后1～2針經常難以確定吻合血管邊緣的空隙。如果采用降落傘法,一側血管壁縫合結束后一起拉緊縫線,受腹主動脈外膜影響,常導致縫線無法拉緊甚至斷線。(3) 連續縫合易導致吻合口狹窄、血栓等不良反應[7],成為制約建模成功的主要原因。

Sapountzis等[8]首先報道在顯微外科血管吻合中使用連續縫合間斷打結的方法,操作要點是:在縫合兩端的錨定線后,從一側開始連續縫合血管壁,但不拉緊縫線,而是留出較長的線圈,達到對側錨定線后,中間剪斷線圈,各自線圈的頭尾線分別打結。我們將此法應用于小鼠心臟移植動脈吻合(圖4)。

A:Running suture using open loop with the length of about 1.3 cm;B:The loop was cut,and suture was tied individually as interrupted method.

圖4建立縫合線圈

Fig 4Establishment and cut of loop

在應用過程中,我們發現本法的主要優點是:(1) 兩側血管壁都是在充分顯露血管腔的條件下進行縫合,最后縫線再分別打結,因此視野清晰,這對小鼠心臟移植的動脈吻合有著重要的意義。(2) 本法解決了吻合血管不匹配的難題。由于最后所有的縫線分別打結,打結時調整縫線偏向就可以糾正偏差。(3)單純間斷縫合法是顯微血管吻合的“金標準”。相對于小靜脈吻合,動脈血管壁順應性差、彈性大,更加適用間斷縫[9],但這又與器官移植的缺血時限相矛盾。連續縫合間斷打結法解決了這一矛盾，相對于間斷縫合,本法連續運針,節省了中間剪線和換針的時間。常規間斷縫合法通常先固定兩端,再縫中點,后提中點線,縫合最后2針時經常顯露不佳,而應用本法,最后2針縫合時管腔顯露清楚,縫合更確切。吻合后供受體血管匹配良好,未出現連續縫合后由于匹配不良引起的吻合口大出血 (圖5)。

A:The left side of aort a was completed;B:The right side of aort a was completed, and the end of sutures must be cut as short as possible to avoid interference of venous anastomosis;C:Anastomoses of aorta and inferior vena cava were completed.

圖5吻合口處血管匹配良好

Fig 5Good matching of anastomosic vessels

本法的不足之處在于:(1)剪斷“線圈”后線尾易糾結在一起,打結拉線時可能會發生錯誤,將臨近的縫線拉出。(2) 腹主動脈右側壁縫合后殘余的線尾可能會干擾下腔靜脈左側壁的縫合,操作過程中應加以注意。綜上所述,連續縫合間斷打結是建立小鼠腹部心臟移植模型的良好動脈吻合方式,簡單易學,值得推廣。

致謝復旦大學附屬中山醫院麻醉科何義舟主治醫師指導手術操作。

參考文獻

[1]彭潤生,王春生,楊兆華.小鼠腹部心臟移植模型的顯微外科技巧及并發癥的預防[J].復旦學報(醫學版),2008,35 (3):411-413.

[2]張善中,譚建明,唐孝達.血管化小鼠異位心臟移植模型[J].中華實驗外科雜志,2006,23 (10):1276.

[3]CORRY RJ,WINN HJ,RUSSELL PS.Primarily vascularized allografts of hearts in mice.The role of H-2D,H-2K,and non-H-2 antigens in rejection[J].Transplantation,1973,16 (4):343-350.

[4]QIAN SG,FUNG JJ,DEMETRIS AV,etal.Orthotopie liver transplantation in the mouse[J].Transplantation,1991,52 (3):562-564.

[5]STEWART S,WINTERS GL,FISHBEIN MC,etal.Revision of the 1990 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart rejection[J].HeartLungTransplant,2005,24 (11):1710-1720.

[6]HUANG LJ,REESE S,DJAMALI A.Contributing factors to complications andsurgical success in mouse kidney transplantation[J].IntBrazJUrol,2012,38 (3):395-403.

[7]TOZZI P,HAYOZ D,RUCHAT P,etal.Animal model to compare the effects of suture technique on cross-sectional compliance on end-to-side anastomoses[J].EurJCardiothoracSurg,2001,19 (4):477-481.

[8]SAPOUNTZIS S,KIRANANTAWAT K,LIM SY,etal.A novel “continuous-interrupted” method for micro-vascular anastomosis[J].Microsurgery,2014,34 (1):82-84.

[9]UMEZAWA H,OGAWA R,NAKAMIZO M,etal.A comparison of microsurgical venous anastomosis techniques[J].NipponMedSch,2015,82 (1):14-20.

The continuous-interrupted method for arterial anastomosis in mouse heart transplantation

CUI De-li1▲, TAN Chang-jun2▲, LIU Zhong1△

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,LiaoningProvince,China;2LiverCancerInstitute,ZhongshanHospital,FudanUniversity-Shanghai

KeyLaboratoryofOrganTransplantation,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the feasibility of continuous-interrupted method for arterial anastomoses in mouse model of heart transplantation.MethodsHeterotopic heart transplantations were performed from inbred C57BL/6j( (H-2b)) mouse (n=30) to BALB/c( (H-2d)) mouse (n=30),in which the graft′s ascending aorta was anastomosed end-to-side to the recipient′s aorta by continuous-interrupted sutures,and the pulmonary artery was anastomosed end-to-side to the inferior vena cava by continuous one-suture anastomosis.The survival time of grafts and the duration of cardiac impulse were observed.ResultsThe successful rate of transplantation was 90% (27/30).Total operation time was (91.77±6.70) min with,arterial anastomosis time of (24.63±1.67) min and venous anastomosis time of (15.17±1.80) min.Median beating time of donor heart was 8 days with acute rejection reaction indicated by pathological histology.ConclusionsThe technical difficulties of arterial anastomosis were reduced greatly by continuous-interrupted method, and we recommended this method for mouse heterotopic cardiac transplantation.

【Key words】mouse;animal model;heart transplantation;arterial anastomosis

(收稿日期:2015-06-24;編輯:段佳)

【中圖分類號】R654.2

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.015

國家自然科學基金面上項目(81373874,81472218)

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:liuzhong69@sohu.com