別克參多糖提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

摘要：以熱水浸提法提取別克參[Erythronium japonicum Decne.]多糖，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察別克參多糖體外清除DPPH、ABTS、羥自由基的能力，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶40（mL∶g），提取溫度70 ℃，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間5 h，提取率為41.893 1%。別克參多糖具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：別克參[Erythronium japonicum Decne.]；多糖；提取工藝；體外抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）21-5595-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.040

Optimization of Technology of Extracting Polysaccharides from Erythronium japonicum Decne. Bulb and Its Anti-oxidative Effects in Vitro

WEI Hong，SUN Yu-hong，DONG Wei，YU Wen-ying，XIANG Xue-ying，GAN Yuan-long，CHEN Chun-li

（Pharmacy College of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract：The extraction of Erythronium japonicum Decne. bulb polysaccharides through hot water decoction was optimised using single factor experiment and an orthogonal test. The antioxidant activities of the polysaccharides were assessed in vitro using DPPH radical，ABTS radical and Hydroxyl radical. The resuls showed that the optimum extraction conditions were extraction time of 5 h，extraction temperature of 70 ℃，ratio of liquid to raw material of 1∶40（mL/g） and extraction cycle number of three. The experimental yield was 41.893 1%. The results showed that Erythronium japonicum Decne. bulb polysaccharides exhibited certain effects on radical scavenging.

Key words： Erythronium japonicum Decne.’s bulb；polysaccharides；technology of extracting；anti-oxidative effect in vitro

新疆豬牙花（Erythronium japonicum Decne.），又名西伯利亞豬牙花、阿爾泰山豬牙花、雞腿參，為百合科（Liliaceae）豬牙花屬（Erythronium）植物，是哈薩克民族食用和藥用的植物之一，其干燥肉質(zhì)鱗莖別克參有滋補(bǔ)、強(qiáng)身壯體等保健功能，是哈薩克民族治療體虛多病、腰膝酸軟、無(wú)力等疾病的民間傳統(tǒng)醫(yī)藥材料[1，2]。多糖為別克參的主要成分之一[3]。研究表明，植物多糖具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗癌、抗心肌缺血、抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝血等藥理作用[4-9]，但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)別克參多糖的研究較少。本試驗(yàn)以熱水浸提法提取別克參多糖，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察別克參多糖體外清除DPPH、ABTS、羥自由基的能力，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為深入研究別克參多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

別克參藥材，產(chǎn)于新疆阿勒泰，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為新疆豬牙花的鱗莖。

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（美國(guó)Sigma公司）、無(wú)水乙醇、抗壞血酸、鄰二氮菲、硫酸鐵、過(guò)氧化氫、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、過(guò)二硫酸鉀、H2O2溶液，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1001型，上海愛(ài)朗儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（TDL-5A型，上海菲恰爾分析儀器有限公司）；電子分析天平（BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司）；真空干燥箱（DZF-6051型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2550型，日本島津制作所）。

1.3 方法

1.3.1 藥材前處理 稱(chēng)取一定量別克參粉末，加15倍量的95%乙醇在40 ℃下超聲30 min。以上操作重復(fù)3次后，干燥脫脂，備用。

1.3.2 提取工藝流程 取已脫脂別克參粉末2 g采用熱水提法進(jìn)行提取，離心后上清液濃縮至10 mL，加40 mL無(wú)水乙醇放入冰箱過(guò)夜，離心，取沉淀減壓干燥即得別克參多糖粗品，減重法稱(chēng)得多糖含量。以上提取操作均重復(fù)3次。以提取多糖的質(zhì)量占脫脂別克參質(zhì)量的百分比為提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 分別研究不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)別克參多糖提取率的影響。從以上4個(gè)方面設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，料液比（m∶V）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45；提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃；提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。

1.3.4 別克參多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)別克參提取率的影響，采用正交試驗(yàn)（表1）優(yōu)化別克參多糖提取的工藝條件。

1.3.5 別克參多糖抗氧化活性測(cè)定 分別采用ABTS法[10，11]、DPPH法[12，13]、羥自由基法[14，15]測(cè)定別克參多糖抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)別克參多糖提取率的影響 如圖1所示，隨著料液比的增加，別克參多糖提取率也逐漸升高，當(dāng)料液比為1∶35時(shí)提取率達(dá)到峰值，隨后提取率變化較小，因此，料液比為1∶35時(shí)提取效果較好。

2.1.2 提取溫度對(duì)別克參多糖提取率的影響 由圖2可知，提取溫度為60～80 ℃時(shí)，對(duì)別克參多糖的提取率影響很大，提取率隨著提取溫度升高而升高，80 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大，之后隨著提取溫度的升高提取率變化不明顯，因此，提取溫度為80 ℃時(shí)提取別克參多糖的效果較好。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)別克參多糖提取率的影響 由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，別克參多糖的提取率逐漸上升，當(dāng)提取時(shí)間增加到4 h以后，隨著提取時(shí)間的增加，別克參多糖的提取率變化不明顯。因此，4 h為較優(yōu)提取時(shí)間。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)別克參多糖提取率的影響 由圖4可知，提取次數(shù)對(duì)別克參多糖的提取率影響不大，提取2次后多糖基本提取完全，再增加提取的次數(shù)，提取率變化不明顯，因此提取次數(shù)為2時(shí)提取效果較好。

2.2 別克參多糖提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)別克參多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以多糖提取率為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2可知，4個(gè)因素的最佳組合為A1B3C3D3，即料液比1∶40、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間5 h、提取3次。極差分析表明，各因素對(duì)別克參多糖提取率的影響大小順序是提取次數(shù)>料液比>提取溫度>提取時(shí)間。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同組合之間，4個(gè)因素的影響均未達(dá)到極顯著水平，C、D因素的顯著水平明顯高于A、B。因此，別克參多糖的最佳提取條件為料液比1∶40、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間5 h，提取3次。

2.3 別克參多糖抗氧化活性分析

2.3.1 清除ABTS+自由基的能力 不同濃度別克參多糖溶液對(duì)ABTS+·自由基的清除率如圖5所示，不同濃度別克參多糖對(duì)ABTS+·自由基均有一定的清除能力，并隨著濃度的升高，清除率不斷提高，但其清除率明顯低于維生素C。

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 清除DPPH自由基方法快速、簡(jiǎn)便，是目前在植物提取物體外抗氧化活性研究中應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)方法之一，別克參多糖對(duì)DPPH的清除率見(jiàn)圖6。由圖6可知，在所選濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高別克參多糖對(duì)DPPH·的清除率略有上升，當(dāng)濃度達(dá)到0.672 mg/mL以后清除率基本不變，且均低于20%。

2.3.3 清除羥自由基的能力 羥自由基毒性很強(qiáng)、危害很大，一般很難消除[16]。對(duì)羥自由基的清除率是反應(yīng)樣品抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖7可以看出，在所選濃度0.168～1.008 mg/mL中，隨著濃度的升高，別克參多糖對(duì)羥自由基的清除率略有上升，多糖濃度為0.840 mg/mL時(shí)，清除率最大，達(dá)到20.97%。

3 小結(jié)

別克參作為哈薩克族常用藥在臨床上也已使用多年，有著廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)影響別克參多糖提取率的因素進(jìn)行了考察，由結(jié)果可知，各因素對(duì)別克參多糖提取率的影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>提取料液比>提取溫度>提取時(shí)間；別克參多糖的最佳提取條件為料液比1∶40、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間5 h，取次數(shù)3次。在該工藝下，別克參多糖的提取率最高為41.893 1%。

別克參多糖體外抗氧化研究表明，別克參多糖對(duì)ABTS+·、DPPH·、羥自由基均有一定的清除能力，但清除能力均低于維生素C。

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