高溫和利巴韋林對馬鈴薯的生長及PLRV、PYV的影響

摘要：為了了解高溫和利巴韋林處理對馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）卷葉病毒（Potato leave-roll virus， PLRV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Y virus，PYV）脫毒的影響，以寶塔百利、紅王和“803”為材料，采用高溫和化學處理結合莖尖培養技術對上述馬鈴薯進行處理，采用RT-PCR方法檢測病毒基因。結果表明，長時間的高溫處理抑制馬鈴薯組培苗的生長，“803”的存活率最高為80.1%，寶塔百利的存活率最低為41.1%；利巴韋林對馬鈴薯生長的抑制作用較明顯，其濃度超過 75 mg/L時生根效果差，到125 mg/L時對馬鈴薯生長抑制效果最明顯；RT-PCR結果顯示，高溫處理結合利巴韋林的處理上均未檢測到病毒。

關鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosun L.）；高溫處理；利巴韋林；電泳； PLRV；PYV

中圖分類號：S532 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5469-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.009

Effects of PLRV and PYV Virus Elimination from in Vitro Potato by

Thermotherapy Combined with Ribavirin

SHAN Ti-xia， LIAN Yu-ji

（College of Life Sciences， Linyi University，Linyi 276005，Shandong， China）

Abstract： To investigate the effect of high temperature combined with ribavirin on elimination of potato leaf roll virus （PLRV） and potato virus Y（PYV），shoot tip culture of potato genotype Red king，Bora Valley and 803 were used for virus elimination studies. Virus status in vitro plantlets was determined by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results showed that， the glowth of tissue cultured seedings were inhibited after highest temperature（35±1） ℃ treatment and there were the highest survival rates（80.1%） of 803 and the lowest （41.1%） survival rates of Bora Valley. Ribaribin had significant inhibitory effect on growth of potato，when its concentration was more than 75 mg/L，rooting rate was low， and when reached 125 mg/L， inhibitory effect on potato growth was the most obvious. RT-PCR results showed that，the high temperature combined with ribaribin treatment （25～125 mg/L） could effectively eliminate PLYV and PYV.

Key words： potato（Solanum tuberosum L.）； high temperature treatment； ribavirin； electrophoresis； PLYV； PYV

馬鈴薯（S. tuberosum L.）是茄科茄屬一年生草本植物，被聯合國糧農組織確認為世界四大主糧之一，是重要的糧食、蔬菜兼用作物，具有很高的營養價值和藥用價值[1]。近年來，中國也已啟動實施了馬鈴薯主糧化戰略，市場對馬鈴薯的需求隨之逐漸增多，馬鈴薯的栽培面積不斷擴大。但是長期以來有“植物癌癥”之稱的病毒病一直困擾著馬鈴薯的生產發展[2]。馬鈴薯是以營養器官繁殖的無性繁殖作物，在栽培過程中一旦感染了病毒，就會在植株體內增殖，并通過輸導組織運轉、積累到新生營養器官中，導致馬鈴薯植株生長衰退、植株變矮、葉面皺縮、葉片出現黃綠相間的嵌斑，甚至葉脈壞死直至整個復葉脫落、塊莖小或出現尖頭龜裂，使產量降低，品質下降，這種現象稱為馬鈴薯的退化。種薯退化是引起產量降低和商品性狀變差的主要原因，全世界每年由馬鈴薯病毒造成的減產至少為20%。中國由于馬鈴薯病毒病的危害造成的馬鈴薯減產達到50%～70%[3]。

理論上，植物分生組織的維管組織還不健全，從而抑制了病毒向分生組織的增殖；分生組織中的生長素和細胞分裂素水平均很高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制了病毒的合成；在植物分生組織中缺乏或尚未構建病毒的復制所需要的酶系統，因而病毒無法在分生組織中復制。因此，通過植物頂端分生組織培養可有效抑制一些病毒的復制。早在20世紀70年代，中國就已開展了馬鈴薯莖尖脫毒及其良種繁育技術的研究，在生產上推廣應用取得了顯著的增產效益，但是由于種薯繁殖成本較高，加之良種繁育體系不健全等原因，脫毒種薯在生產上的推廣應用非常緩慢[4]。

目前，獲得脫毒馬鈴薯苗的方法主要有物理方法、化學方法、愈傷組織培養包括利用實生種子生產等[5]。其中的物理方法包括低溫、高溫、X射線處理等，而熱處理是最古老有效的方法，植物和病毒對溫度的敏感性是不同的，在高于正常的溫度下，植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化，但很少傷害甚至不傷害寄生組織[6]。

利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷，為鳥苷類化合物，1972年首次合成，對RNA病毒和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性，此后利巴韋林也用于植物脫毒方面的研究[7-12]。利巴韋林是一種常用的病毒滅活劑，且價格低廉，如若處理效果好可能會應用到農業上，這無疑是非常有意義的。

本試驗采用莖尖培養、高溫處理、化學處理相結合的方法，對馬鈴薯品種寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）進行脫毒處理，通過PCR方法檢測馬鈴薯卷葉病毒（Potato leave-roll virus，PLRV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Y virus，PYV）基因，探索高溫和不同濃度利巴韋林處理對馬鈴薯生長的影響，探究高溫和利巴韋林最佳搭配條件對馬鈴薯脫毒的影響，從而找到對馬鈴薯有效方便的脫毒技術，旨在為馬鈴薯的大規模增產增收提供可能，為馬鈴薯的脫毒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯中有寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）3個品種；利巴韋林（辰欣藥業股份有限公司）購于山東省臨沂市康源大藥店。

1.2 方法

1.2.1 莖尖培養與高溫處理 取寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）3個馬鈴薯品種的頂芽，切取大約1 cm的莖尖，莖尖用洗衣粉或洗滌劑清洗粘在表面的灰塵和微生物，再用自來水流水沖洗1～2 h，用紗布或濾紙吸干。在超凈工作臺上先用70%乙醇浸潤15～20 s，再用2%次氯酸鈉滅菌10 min，無菌水沖洗3～5次。將莖尖放在20倍的解剖鏡下進行莖尖剝離，剝下帶1～2個葉原基的莖尖后立即接種在莖尖培養基上。莖尖培養基：MS添加0.2 mg/L GA3，0.1 mg/L NAA和0.5 mg/L BA。每個試管接種一個莖尖，并作好編號和記錄。培養條件為：（25±1） ℃、16 h/d光培養、光量子通量密度4 000 μmol/（m2/s）。試驗剝離30個莖尖，重復3次。培養5周后統計莖尖的存活率、出芽率、污染率。

莖尖培養誘導出的芽生長至5～10 cm，取1～2個節間的莖段轉接到MS培養基上，每個三角瓶接種8個莖段，并作好編號和記錄。于（35±1） ℃、16 h/d光培養、光量子通量密度4 000 μmol/（m2·s）下培養30 d。試驗重復3次，統計莖段的存活率。

1.2.2 利巴韋林處理及植物培養 待培養60 d后，可獲得3～5 cm的小芽。將小芽切成1 cm的莖段，并將其接種到已經用不同濃度（0、25、50、75、100、125 mg/L）利巴韋林處理過的液體MS培養基和固體培養基中。每個處理培養3瓶，共54瓶。然后再培養室條件下培養30 d。觀察并記錄馬鈴薯組培苗的生長狀況。

1.2.3 總RNA提取與cDNA的合成與基因擴增 取固體培養基上處理過的馬鈴薯組培苗幼葉（<100 mg）提取總RNA，提取方法按照Invitrogen公司Trizol Reagent的說明書進行。cDNA的合成利用TaKaRa公司的說明書進行。利用合成的cDNA與TaKaRa公司的PCR擴增試劑盒擴增基因，其反應程序為將PCR反應產物在94 ℃預變性4 min；94 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到復性溫度55 ℃保持40 s，使引物與模板充分退火，在72 ℃保持30 s，重復循環30次；在72 ℃保持10 min，4 ℃保存。PCR擴增所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列 PLRV：上游5′-cgcgctaacagagttcagcc-3′，下游5′-gcaatgggggtccaactcat-3′（336 bp）；PYV：上游5′-cacgattgctcaagcaagaa-3′，下游5′-ggcggagtatgcaccaagta-3′（412 bp）。

2 結果與分析

2.1 莖尖培養

3個馬鈴薯品種莖尖在誘導培養基上培養2周時開始形成愈傷組織，培養60 d左右開始分化出小芽，但小芽出芽率不高，品種間存活率差異不大（表1）。1個月后，將分化的小芽轉接到MS培養基后，在35 ℃下連續培養時，大部分小芽變黃，生長緩慢，培養30 d后，“803”的存活率最高，達到80.1%，紅王和寶塔百利小芽的存活率低于50%，表明持續的高溫處理影響馬鈴薯組培苗的生長。

不同濃度利巴韋林處理對馬鈴薯組培苗的生長影響差異比較明顯。在液體培養條件下，隨著利巴韋林濃度的增高，對組培苗生長抑制作用越強，株高隨濃度增加而逐漸減小。當利巴韋林濃度為 0 mg/L，即僅經過高溫處理的植株的根長最長，50 mg/L利巴韋林處理的植株生長良好，但無根或短小，75 mg/L利巴韋林處理后僅有紅王生出短小的根，75 mg/L以上利巴韋林處理的3種馬鈴薯均無根。利巴韋林濃度超過75 mg/L時，所有植株比較脆，用鑷子取的時候非常容易斷裂并碎成小塊，明顯抑制植株的生長。此外，在試驗中發現紅王經100和125 mg/L利巴韋林處理后，植株在切口處生長出微型薯；“803”經50 mg/L利巴韋林處理后的生長要差于另外2個品種，經75 mg/L及以上濃度的利巴韋林處理后生長受到明顯抑制，基本停止生長甚至黃化死亡。在固體培養條件下，利巴韋林對馬鈴薯組培苗生長的抑制效果與液體培養方法相似，但根系生長良好（表2）。除“803”外，其他2個品種在100 mg/L利巴韋林處理中也能生根，未觀察到變黃枯萎植株。

2.2 不同濃度利巴韋林處理對3種馬鈴薯品種的PYV、PLRV的抑制影響

PLRV和PYV的RT-PCR結果顯示，125 mg/L利巴韋林處理后的3種馬鈴薯試管苗均未顯示病毒條帶（圖1），與此相反，陽性對照上分別顯示病毒基因條帶，說明利巴韋林對病毒有抑制作用。

經高溫處理后生存的紅王、“803”、寶塔百利在不同濃度利巴韋林處理的培養基上生長后均未觀察到病毒基因條帶（圖1），說明高溫熱處理對去除馬鈴薯病毒有一定作用。而不同濃度的利巴韋林處理的馬鈴薯，雖然高濃度（高于50 mg/L）會影響馬鈴薯的生長分化，但其對馬鈴薯的PLRV、PYV病毒抑制作用卻是顯而易見的。檢測后，選擇高濃度利巴韋林處理過的植株轉接到增殖培養基上，在培養室中進行回復生長。單獨熱處理或單獨化學處理都未能有效去除馬鈴薯病毒[13]，而通過外源植物生長調節劑、高溫處理和化學試劑的共同作用則為解決這一問題提供了一個很有效的途徑，為未來植物脫毒提供了良好的借鑒意義。

3 討論

馬鈴薯是世界上重要的糧食和經濟作物，但病害一直是限制馬鈴薯生產的主要因素，其中病毒病影響馬鈴薯的質量， 導致品種嚴重退化[1]。在發展中國家馬鈴薯因病害每年導致數億美元的損失[14，15]，脫毒馬鈴薯種薯可大大提高馬鈴薯產量，增加農民的經濟收入。利用物理和化學相結合的方法處理植物，在有效鈍化病毒復制的同時又不會對植物造成較大的傷害，并以此獲得脫毒苗的研究很早就已經開始，其中物理方法中的高溫處理是比較有效的[16，17]。本試驗中35 ℃處理馬鈴薯1個月可以明顯地去除馬鈴薯PYV，這與Faccioli等[18]的研究結果相似，他們發現35 ℃處理馬鈴薯16～27 d可以脫去PLRV和PYV。但是Mahmoud等[19]發現37 ℃處理馬鈴薯30～40 d不能有效地除去馬鈴薯病毒。本試驗中35 ℃處理馬鈴薯1個月后得到的馬鈴薯苗生長狀況良好，也未有檢測到PYV，這可以說明1個月的處理時間是十分合理也是十分有效的。雖然本次試驗無法證明高溫處理可否去除PLRV，但是已有很多研究發現高溫條件下可以脫除PLRV。

利巴韋林是一種常見的廣譜抗病毒藥物，可應用于馬鈴薯的脫毒。Cassells等[16]將利巴韋林加入到培養基中，培養馬鈴薯分生組織和外植體，可有效去除馬鈴薯的X、Y、S和M病毒。Asjes等[14]采用莖尖脫毒加熱處理結合40 mg/L利巴韋林處理的方法獲得脫毒苗。同時Klien等[17]研究發現利用莖尖分生組織培養技術和利巴韋林處理能夠有效地去除PLRV和PYV，但莖尖的分化與生長受到抑制。本試驗發現利巴韋林對植物生長具有一定抑制作用，當利巴韋林濃度為50 mg/L時馬鈴薯組培苗生長受到抑制，當利巴韋林濃度達到75 mg/L或更高濃度時，其對馬鈴薯組培苗生長的抑制效果更明顯，有的停止生長，甚至黃化死亡。但在50 mg/L利巴韋林處理后未檢測到PLRV和PYV病毒條帶，這說明50 mg/L的濃度也可有效地去除PLRV和PYV。

本研究結果表明，將莖尖培養后獲得的小植株轉移到35 ℃下持續培養1個月，最后取高溫處理苗莖尖并添加50 mg/L左右利巴韋林處理可有效去除馬鈴薯PLRV和PYV。總之，單一的莖尖培養技術不能有效地獲得脫毒植株。在獲得脫毒馬鈴薯時，可以取其大約1 cm的莖尖，在35 ℃條件下連續培養1個月（30 d），然后再次取其大約1 cm的莖尖，嘗試用低于50 mg/L的利巴韋林處理，這應該是一種簡單有效的方法，操作簡單，易于推廣。這種技術對獲得脫毒馬鈴薯，提高馬鈴薯的產量，滿足市場需求，增強中國馬鈴薯生產在世界上的競爭力具有十分重要的意義。

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