豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

摘要：為了摸清引起湖北某豬場3日齡內(nèi)仔豬以出血性下痢、死亡率高的疾病病因，經(jīng)病料涂片鏡檢、培養(yǎng)基接種、生化試驗(yàn)和血清型鑒定，診斷為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，該菌厭氣肉肝湯培養(yǎng)物上清0.001 mL可引起小鼠全部死亡，具有較強(qiáng)的毒力。

關(guān)鍵詞：仔豬；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；分離與鑒定

中圖分類號：S852.61+6.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6190-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.047

Abstract：For clearing the high mortality disease of Hemorrhagic dysentery in piglets with day 3 at a pig farm in Hubei，the samples were taken to smear test under microscope and medium culture. After biochemical test and serotypes identification，the isolated bacteria were diagnosed Clostridium perfringens type C. The culture fluid of anaerobic broth induced the death of all mice only by 0.001 mL which showed high toxicity. It indicated that the disease in the farm were caused by the infection of Clostridium perfringens type C.

Key words： piglet； Clostridium perfringens type C； isolation and Identification

湖北某豬場發(fā)生1～3日齡仔豬出現(xiàn)急性死亡的病例，發(fā)病仔豬表現(xiàn)發(fā)病急，死亡快，排出含有灰色組織碎片及多量氣泡的紅褐色液狀稀糞，發(fā)病豬死亡率很高，病理剖檢表現(xiàn)為空腸外觀呈深紅色，腸管內(nèi)容物呈紅黃色或暗紅色。經(jīng)細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)和血清型鑒定，診斷為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠（16～20 g），購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D型標(biāo)準(zhǔn)定型血清購自中國獸藥監(jiān)察所。厭氣肉肝湯和血液瓊脂平板按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》制備。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和接種 無菌采取病死豬的十二指腸和空腸內(nèi)容物涂片，革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察。并取十二指腸和空腸內(nèi)容物接種厭氣肉肝湯，37 ℃培養(yǎng)10～18 h。

1.2.2 細(xì)菌的溶血性試驗(yàn) 取上述厭氣肉肝湯培養(yǎng)基中的疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于血液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察血平板上是否有產(chǎn)氣莢膜梭菌特有的α、β雙溶血環(huán)。

1.2.3 分離菌株的生化鑒定 挑取有清晰雙溶血環(huán)的產(chǎn)氣莢膜梭菌典型菌落進(jìn)行純化，然后將純化的菌落接種生化培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)[1]。

1.2.4 分離菌株的血清型鑒定 將分離菌株厭氣肉肝湯培養(yǎng)物用3 000 r/min離心30 min，取上清與產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D型定型血清進(jìn)行中和，尾靜脈接種昆明小鼠進(jìn)行中和試驗(yàn)，確定菌株血清型[2]，同時(shí)用5只尾靜脈注射生理鹽水作為對照組。

1.2.5 分離菌株的產(chǎn)毒素能力試驗(yàn) 將分離菌株厭氣肉肝湯培養(yǎng)物用3 000 r/min離心30 min，取上清0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.001 5和0.002 0 mL，分別將其稀釋成0.5 mL，各稀釋度分別尾靜脈注射昆明白鼠各5只，觀察24 h內(nèi)小鼠的死亡情況。

1.2.6 兔泡沫肝試驗(yàn) 取分離菌厭氣肉肝湯培養(yǎng)物，3 mL靜脈注射家兔，1 h后處死家兔，將家兔置37 ℃恒溫箱 8 h，然后進(jìn)行剖檢，觀察肝臟的組織病變并進(jìn)行涂片鏡檢[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂片鏡檢結(jié)果

取病死豬的腸等內(nèi)容物或黏膜抹片，革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察?？梢姼锾m氏染色呈陽性、兩端鈍圓的粗大桿菌，有莢膜。

2.2 培養(yǎng)基接種結(jié)果

分離菌株在厭氣肉肝湯中生長迅速，在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量氣體；在血液瓊脂平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)24 h，形成1～2 mm、半透明、灰白色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落，菌落周圍呈現(xiàn)β、α雙溶血環(huán)。

2.3 分離菌株生化鑒定結(jié)果

由表1可知，菌株純培養(yǎng)物能使石蕊牛乳爆裂發(fā)酵，能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、果糖、甘油、半乳糖等，能使其產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不發(fā)酵甘露醇、鼠李糖和靛基質(zhì)；M.R試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)呈陰性，該菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果與產(chǎn)氣莢膜梭菌生化試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 分離菌株的血清型鑒定

將分離菌株培養(yǎng)物的離心上清接種小白鼠，結(jié)果，C型標(biāo)準(zhǔn)血清能中和培養(yǎng)物上清液中的毒素，小白鼠全部存活，而A、D型血清中和的上清液注射的小白鼠全部死亡，B型血清可部分中和培養(yǎng)物上清液的毒素，小鼠40%（2/5）死亡，表明分離菌株的血清型為C型。

2.5 分離菌株的產(chǎn)毒素能力試驗(yàn)結(jié)果

不同劑量的分離菌株厭氣肉肝湯培養(yǎng)物上清液靜脈注射小鼠后，0.000 1 mL可分別致小鼠40%死亡（2/5）、0.000 5 mL可分別致小鼠60%死亡（3/5），0.001 0 mL以上可致小鼠在24 h內(nèi)全部（8/8）死亡。

2.6 家兔泡沫肝試驗(yàn)結(jié)果

將放置恒溫箱8 h的家兔腹圍顯著增大，剖檢可見，家兔肝臟腫脹成泡沫狀，比正常肝脹大1～3倍，且肝組織易碎，一觸即破，肝臟充滿氣體。將肝組織圖片鏡檢，可見革蘭氏陽性大桿菌。

3 小結(jié)與討論

1）產(chǎn)氣莢膜梭菌是一類革蘭氏陽性、嚴(yán)格厭氧，有芽孢的大桿菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的主要毒素包括α、β、ε和ι等，依據(jù)此可以將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E型產(chǎn)氣莢膜梭菌。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起新生仔豬出血樣、壞死樣腸炎，又稱為仔豬紅痢，該病在3日齡仔豬發(fā)病最普遍，最早可以在出生后12 h內(nèi)發(fā)生，發(fā)病急，死亡快，最急的臨床癥狀多不明顯，一發(fā)現(xiàn)癥狀即迅速死亡，發(fā)病率可達(dá)40%～50%，死亡率可高達(dá)100%。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌繁殖快、世代間隔短，在數(shù)小時(shí)內(nèi)，該菌可以大量增值，增值的細(xì)菌黏附在空腸上皮細(xì)胞的絨毛頂部，緊鄰脫落的細(xì)胞，在基底膜處大量增值，導(dǎo)致絨毛基底膜大量壞死、出血。而在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染致病過程中，能致死的、壞死性的β毒素起關(guān)鍵作用，由于仔豬的腸道正常環(huán)境遭到破壞和毒素的作用，導(dǎo)致發(fā)病仔豬的急性和高死亡率[4]。

2）本研究通過采取發(fā)病仔豬腸道內(nèi)容物進(jìn)行涂片鏡檢和接種適宜培養(yǎng)基，涂片經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡地下可見革蘭氏陽性粗大桿菌，該菌在厭氣肉肝湯中生長迅速，產(chǎn)生大量毒素，小劑量靜脈注射即能致死小白鼠，證實(shí)分離菌株有較強(qiáng)毒力。血清學(xué)鑒定證明，該分離菌株產(chǎn)生的毒素能與標(biāo)準(zhǔn)C型定型血清完全中和，靜脈注射小白鼠后不出現(xiàn)死亡，證實(shí)其為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3）由于仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要發(fā)生于3日齡內(nèi)的仔豬，而且發(fā)病急、死亡快，對于已經(jīng)出現(xiàn)臨床癥狀的仔豬，治療的作用甚微，因此加強(qiáng)預(yù)防是防制本病發(fā)生的較好方法。目前最有效的預(yù)防方法就是在懷孕母豬在產(chǎn)仔前用仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病滅活疫苗進(jìn)行免疫，通過免疫可以在一個(gè)繁殖周期可以消除該病的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李一經(jīng).獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2011.

[2] 劉澤文，熊忠良，楊克禮，等.新生仔豬紅黃痢二聯(lián)滅活疫苗的研制與應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（21）：9063-9064.

[3] 郭定宗.獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[4] JEFFERY J，ZIMMERMAN，LOCKE A，等.豬病學(xué)[M].第10版.趙德明，張中秋，周向梅等，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2014.