微波輔助酶法提取大葉梔子花總黃酮的工藝研究

摘要：為優化微波輔助酶法提取大葉梔子花（Gardenia jasminoides var. grandiflora）總黃酮工藝。在單因素試驗基礎上，應用中心組合設計，采用二次多項式逐步回歸分析對提取工藝條件進行優化，確定了微波輔助酶法提取大葉梔子花總黃酮工藝的最佳條件，即酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時間為1.0 h；按此工藝條件，大葉梔子花總黃酮提取率可達2.16%。

關鍵詞：大葉梔子（Gardenia jasminoides var. grandiflora）；總黃酮；微波輔助提取法；纖維素酶解法

中圖分類號：TQ461 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6219-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.055

Abstract：For optimizing the technology of extracting total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora by microwave-assisted enzymatic method， based on single factor experiment and by application of central composite design， the technological conditions for extracting total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora were optimized with quadratic polynomial stepwise regression analysis. It was concluded that the optimal conditions for the extraction were the enzyme dosage of 1.8%， pH 5.0， enzymolysis temperature of 70 ℃， and enzymolysis time for 1.0 h. Under these conditions， the extraction yield of total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora was up to 2.16%.

Key words： Gardenia jasminoides var. grandiflora； total flavonoids； microwave-assisted extraction； cellulase enzymatic method

大葉梔子（Gardenia jasminoides var.grandiflora）屬于茜草科梔子屬物種[1]，又名大花梔子、荷花梔子、牡丹梔子，為常綠灌木，主要分布在江蘇、浙江、四川等地[2]。其葉大，花大而富濃香、重瓣，不結果。大葉梔子花通常被修剪成球狀植于街道旁或者公園景觀中，用于綠化造景[3]。其葉、花中含有大量的黃酮類化合物。藥理實驗表明，黃酮類化合物有明顯的抗潰瘍、解痙、抗炎及降血脂等生物活性[4]。目前，對茜草科植物梔子果實中提取黃酮類化合物的文獻報道較多[5-8]，但對大葉梔子花中黃酮類化合物的提取工藝研究報道很少。以大葉梔子花為原料，對影響其黃酮提取的主要因素用響應面試驗，以總黃酮提取率為指標，用方差分析法進行分析，從而優選大葉梔子花總黃酮的提取條件并測定其黃酮提取率，為大葉梔子花資源的合理利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大葉梔子的花采自贛州生態公園，經贛南醫學院藥學院中藥鑒定教研室程齊來教授鑒定。

蘆丁標準品（含量≥98%，天津一方科技有限公司）；纖維素酶（3×104 U/g，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司）；無水乙醇、石油醚、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

UV-6100PCS型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；WF-4000微波快速反應系統（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW135手提中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；202A-2電熱干燥箱（上海陽光試驗儀器有限公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取13.50 mg蘆丁標準品，試驗用現配的60%乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得135.0 mg/L的蘆丁標準儲備溶液。再精密量取蘆丁標準儲備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10.0 mL容量瓶中。依次分別加60%乙醇稀釋至5.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，迅速搖勻，靜置6 min，最后加入4 mL的4%氫氧化鈉溶液，混勻，用乙醇稀釋至刻度，充分搖勻。放置15 min后，以不加蘆丁的試劑作空白對照，檢測波長設定為509 nm。得吸光度（Y）與濃度X（mg/L）的標準回歸方程Y=0.010 0X-0.000 6，R2=0.999 3。

1.2.2 大葉梔子花總黃酮的提取 大葉梔子花脫脂粉的制備：將烘干的大葉梔子花粉碎后，過60目篩，用一定比例[固液比（g/mL）=1∶30]的石油醚超聲提取30 min，棄去石油醚，濾渣揮干石油醚，干燥后冷卻備用。稱重。

酶處理：準確稱取大葉梔子花脫脂粉1.0 g加20 mL去離子水，置于250 mL具塞錐形瓶中，用鹽酸溶液調pH，加入一定量纖維素酶在一定溫度下恒溫反應一定時間后（水浴鍋中振蕩酶解160 r/min），沸水中滅活2 min，室溫下抽濾分離固體殘渣和濾液Ⅰ。

微波萃取：取20 mL 70%的乙醇溶液加入到濾渣中，移入微波快速反應系統中，微波輔助處理4 min，趁熱過濾，得濾液Ⅱ，合并濾液Ⅰ和濾液Ⅱ，適當減壓濃縮，用70%乙醇定容于50 mL的容量瓶中備用。

1.2.3 總黃酮含量測定 吸取2 mL濾液于10 mL容量瓶中，按標準曲線下的測定方法測吸光度，計算總黃酮提取率。

1.2.4 單因素試驗 ①酶用量。分析不同比例酶用量（1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%）對大葉梔子花總黃酮提取率的影響；②pH。分析不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對大葉梔子花總黃酮提取率的影響；③酶解溫度。考察不同酶解溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）對大葉梔子花總黃酮提取率的影響；④酶解時間。考察不同酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對大葉梔子花總黃酮提取率的影響。⑤微波萃取時間。考察不同微波萃取時間（2、4、6、8、10 min）對大葉梔子花總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取酶用量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）4個對總黃酮提取率影響較大的因素，對提取工藝條件進行響應面分析。試驗因素水平及編碼見表1。

1.2.6 驗證試驗 對Box-Behnken中心組合試驗優化后的大葉梔子花總黃酮提取工藝進行驗證試驗，重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著酶用量的增大，總黃酮的提取率也隨之增大，當酶用量達到2.2%時，單位底物上的酶達到飽和濃度，總黃酮提取率達到最大值。隨后增加酶的濃度，此時增加結合位點也無法與更多的底物反應，總黃酮提取率反而下降，這是因為酶用量過于飽和后，包裹住試材顆粒，反而不利于黃酮類物質的溢出[9]。故酶用量最佳為2.2%。

2.1.2 pH對大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖2可知，在pH為5.5時，總黃酮提取率最大。低于此值，總黃酮的提取率隨pH增加而增大；高于此值時，總黃酮的提取率隨pH增加而減少。這是因為pH過小或過大都能使酶變性而失活，因此選擇酶解體系的最適pH為5.5。

2.1.3 酶解溫度對大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖3可知，酶解溫度在65℃時，總黃酮提取率最大。低于此值，總黃酮的提取率隨溫度增加而增大；高于此值時，總黃酮的提取率隨溫度增加反而逐漸減少。這是因為未達到酶活性的最適溫度時，活性無法得到充分發揮，但溫度過高也會導致酶失活以及變性[10]。因此，65 ℃是大葉梔子花總黃酮提取的適宜酶解溫度。

2.1.4 酶解時間對大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著酶解時間的增加，總黃酮提取率先逐漸增大，酶解時間達到1.5 h時，總黃酮提取率達到最大值；隨后，繼續增加酶解時間，提取率反而逐漸下降，故將最佳酶解時間定為1.5 h。

2.1.5 微波萃取時間對大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著微波萃取時間延長，大葉梔子花總黃酮提取率先增加后下降。當微波萃取時間為4 min時，提取率達到最大值。隨后繼續增加微波處理時間，總黃酮提取率呈下降趨勢，主要是因為反應體系受熱時間過長，會導致黃酮類結構破壞，致使提取率下降。因此確定微波萃取最佳時間為4 min。

2.2 回歸模型的建立及方差分析

應用Design-Expert 8.0.6.0軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，對試驗結果進行響應面分析，得出方差分析結果（表3）和響應曲面圖（圖6）。

通過多元回歸擬合分析得到大葉梔子花總黃酮提取率（Y）與酶用量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）之間的二次多項回歸方程：Y=46.235 0-4.183 3×A-4.981 7×B-0.899 8×C+1.207 5×D+0.85×A×B-0.021 3×A×C+0.787 5×A×D-0.036×B×C-0.11×B×D-0.087×C×D-0.041 7×A2+0.498 3×B2+0.010 1×C2+1.088 3×D2。

由表3可以看出，回歸方程P<0.01，表明該回歸模型達到極顯著水平。模型的確定系數達0.980 5，說明該模型能解釋98.05%響應值的變化。失擬項不顯著（P=0.125 4>0.05），表明方程對試驗擬合良好，試驗誤差小。pH和酶解溫度對總黃酮提取率影響極顯著（P<0.01），酶用量對總黃酮提取率的影響顯著（P<0.05），酶解時間對試驗結果影響不顯著（P>0.05）。考察因素間的交互作用，由表3方差分析可知，在試驗所建立的數學回歸模型中，AB、AD、BC和CD之間存在極顯著的交互作用，即酶用量與pH、酶用量與酶解時間、pH與酶解溫度和酶解溫度與酶解時間的交互作用對總黃酮提取率有極顯著的影響（P<0.01）。根據Design-Expert 8.0.6.0軟件對試驗結果進行最優化分析，確定最佳工藝參數：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時間為1.0 h，在此條件下預測總黃酮的提取率為2.23%。

2.3 驗證試驗

為了驗證模型的可靠性和穩定性，在最佳工藝條件：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70℃，酶解時間為1.0 h，進行驗證試驗（平行3次）。結果表明，總黃酮的提取率為2.16%（n=3）。

3 小結與討論

微波輔助提取又稱微波萃取，是利用微波瞬間穿透物料里外同時加熱進行萃取的一種新技術。與傳統的回流萃取、索氏萃取和超聲波萃取等方法相比，具有設備簡單、適用范圍廣、萃取率高、速度快、省時、省試劑、污染小、安全、節能等特點[11]。纖維素酶法能有效水解植物細胞壁上的纖維素，促進黃酮類物質溶出，從而提高提取率。因此采用纖維素酶解與微波萃取相結合的方法可以獲得理想的效果。

本研究采用微波輔助酶法提取大葉梔子花中總黃酮，工藝處理條件較溫和，通過試驗得出的最佳工藝參數：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時間為1.0 h，該條件下總黃酮提取率為2.16%（n=3），試驗結果略高于響應面設計試驗的平均水平，說明最佳工藝條件合理，提取效果較好。該研究結果可為大葉梔子花資源的合理開發利用提供參考價。

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