減毒雞白痢沙門菌△aroA株的構建與致病性分析

摘要：以雞白痢沙門氏菌c79-3強毒株為親本，通過λ-red同源重組系統構建雞白痢沙門菌aroA基因缺失株△aroA，并進行了測序驗證和毒力試驗。結果表明，aroA基因缺失株的生長速度較親本株緩慢，且該缺失株具有良好的遺傳穩定性；相比野生菌株，aroA基因缺失株的毒力發生了下降，雛雞攻毒死亡率較親本株低。本研究獲得的減毒雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株△aroA，為進一步研究雞白痢沙門氏菌aroA基因的功能和后續減毒活疫苗開發奠定了基礎。

關鍵詞：雞白痢沙門氏菌；λ-red同源重組；aroA基因；生物學特性；活疫苗

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6195-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.049

Abstract：The △aroA mutant was constructed by the λ-red recombinant based on c79-3 virulent strain and was confirmed by PCR and sequencing. The growth characteristics and genetic stability of the mutant strain was tested. The results showed that the growth rate of △aroA mutant was slow than the parent strain and was stable. The pathogenecity tests on one day-old chicks. The results showed that compared with wild strains， the virulence of aroA gene deletion mutant was decreased， and the attack rate of chicken was lower than that of the parent strain. In conclusion，we successfully obtained △aroA mutant strain and this study provided basic data for further study of the functions of the aroA gene and live attenuated vaccine.

Key words： Salmonella pullorum； λ-red recombinant system； aroA gene； biological characteristic； live vaccine vector

沙門氏菌屬包含2 500多種血清型，其中包括了腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等人畜共患血清型以及具有宿主高度專一性的雞白痢沙門氏菌血清型。雞白痢（pullorumdisease，PD）是由對家禽具有高度的適應性的雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）引起的一種多發性傳染病[1]。雞白痢沙門氏菌可水平傳播，易感染三周齡以下的雛雞，且有較高的致死率[2]。此外，它還能持續感染脾臟和生殖道數月時間，引起產蛋和后代的垂直感染[3]。雞白痢在發達國家已經被根除，但仍在世界范圍內特別是發展中國家引起巨大的經濟損失[4，5]。雞群長時間高水平感染和抗生素濫用導致細菌的耐藥性持續增加，導致雞白痢更加難以控制。一個好的控制雞白痢沙門氏菌感染的方法有巨大的應用前景[6]。

疫苗的應用也能很好的控制和預防沙門氏菌的感染[7]。目前在國際上得到應用的沙門氏菌疫苗主要有雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞腸炎沙門氏菌苗等。在歐洲禽類養殖國家，沙門氏菌疫苗的應用在防治沙門氏菌感染方面起到了非常重要的作用。許多研究表明減毒活疫苗的效果要優于滅活苗，由于沙門氏菌是一種兼性胞內寄生菌，特異性細胞免疫是控制它的關鍵。與滅活苗相比，減毒活疫苗能優先刺激機體產生細胞免疫，具有更高的效率[8]。然而在中國，尚未有自主研發且匹配中國流行菌株的沙門氏菌疫苗產品。因此，研發針對雞白痢的減毒活疫苗對中國禽類養殖具有重大意義。本研究以野生強毒株C79-3為親本，通過λ-red同源重組系統[9，10]構建芳香族氨基酸合成相關基因aroA缺失株△aroA，達到干擾細菌代謝，降低毒性的效果，從而為研發更加安全有效的減毒活疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、試驗動物

雞白痢沙門氏菌強毒株c79-3；Red同源重組所需質粒pKD3、pKD46、pcp20由揚州大學彭大新教授饋贈；1日齡白來航雛雞由購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司的SPF雞胚自孵。

1.2 主要試劑和培養基

甘油、氨芐青霉素（Ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）購于美國Sigma公司；普通Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR Max DNA高保真聚合酶、DNA片段回收試劑盒、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司；LB肉湯/瓊脂培養基為美國BD公司產品。

1.3 雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株構建

1.3.1 引物設計 參考Genebank中的雞白痢沙門氏菌（NC_011274）aroA基因序列，用Primer 5設計一對敲除引物Aro1和Aro2（表1）。其中，Aro1由 56 bp的aroA基因上游同源序列A1和擴增質粒pKD3氯霉素抗性基因的上游引物C1（下劃線所示）組成，Aro2由57 bp的與aroA基因下游同源的序列A2和擴增質粒pKD3氯霉素抗性基因的下游引物C2（下劃線所示）序列組成。另外，從aroA基因兩側設計引物P1、P2；aroA基因中間設計上游引物P3和下游引物P4，如表1所示，用于aroA基因缺失構建過程中的PCR驗證。

1.3.2 同源打靶片段的制備 以質粒pKD3為模板，Aro1和Aro2為引物，用PrimerSTAR Max DNA高保真酶進行PCR擴增，擴增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸20 s（35個循環）。經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增并測序成功后，將擴增成功的PCR產物用雙蒸水稀釋100倍當做模板進行2次PCR擴增（確保PCR產物經膠回收后無質粒殘留），利用DNA片段回收試劑盒回收打靶片段，回收后的DNA片段溶于滅菌后的純水中。

1.3.3 重組酶的誘導表達與感受態細胞的制備 將轉化了pKD46的c79-3菌株接種氨芐抗性LB培養基，30 ℃培養過夜；次日按1∶100轉接到50 mL含氨芐青霉素濃度為50 μg/mL LB培養基，30 ℃培養至DD600=0.2左右時，加入終濃度為30 mmol/L的L-阿拉伯糖繼續培養1 h，誘導使質粒pKD46上Exo、Bet和Gam三個發揮重組作用的蛋白得到充分表達。取出培養基冰上預冷10 min，5 000 r/min 4 ℃離心10 min棄培養基；用預冷的10%甘油離心洗滌3次，最后重懸細胞于500 μL預冷的10%甘油中，分裝每管100 μL備用，命名為c79-3/pKD46。

1.3.4 打靶片段電轉化 將約800 ng同源臂引物擴增純化得到的氯霉素抗性基因片段加入制備好的感受態細胞c79-3/pKD46中，輕彈混勻后加入 1 mm電轉杯，靜置30 min后，選擇200 Ω，25 μF， 1 800 V電擊條件用伯樂電轉儀作電轉化，電擊時間為（5.0±0.5） ms。電擊后迅速加入800 μL預冷的LB肉湯培養基，200 r/min 37 ℃培養2 h后3 000 r/min離心5 min收集菌體，涂布于含氯霉素濃度為50 μg/mL的LB平板，30 ℃倒置培養，18 h后挑選氯霉素抗性克隆，并進行PCR驗證。

1.3.5 質粒pKD46去除 用接種環沾取經PCR鑒定重組成功的菌株，在不含任何抗生素的LB平板上劃線后倒置于43 ℃溫箱中培養過夜。次日用10 μL槍頭挑取單克隆，先在含氨芐青霉素的平板上輕點后再以同一槍頭的同一部位于含氯霉素平板上輕點，37 ℃條件下倒置過夜培養，挑選對氨芐青霉素敏感而對氯霉素具有抗性的克隆，命名為△aroA∶∶Cm。

1.3.6 FLP位點專一性重組 將上述消除質粒pKD46的陽性克隆用“1.3.3”中方法制成感受態細胞，選擇“1.3.4”中相同電擊條件電轉質粒pcp20， 30 ℃培養6 h后，升溫到43℃培養過夜，熱誘導質粒pcp20上FLP專一性重組酶表達，消除△aroA∶∶Cm上的氯霉素片段，pcp20為溫敏質粒，升溫后也逐漸丟失。用接種環蘸菌液在無抗性LB瓊脂培養基上劃板，用槍頭沾取單菌落點到氯霉素抗性LB平板和無抗LB平板上，過夜培養后無抗LB平板上長出菌落而氯霉素平板上無菌落生長的表示氯霉素抗性基因已被FLP重組酶成功消除。用鑒定引物做PCR對氯霉素抗性消失的克隆進行鑒定，最終獲得aroA基因缺失株△aroA。

1.4 △aroA遺傳穩定性的鑒定

用LB瓊脂平板對雞白痢沙門菌株c79-3和△aroA進行連續傳代培養至20代，分別選取第5、10、15、20代菌落為模板，用aroA基因內部特異性引物P1、P2進行PCR擴增，用野生c79-3作陽性對照，通過擴增條帶的有無鑒定△aroA菌株的遺傳穩定性。

1.5 △aroA的生長特性研究

以無抗LB瓊脂平板同時劃線培養c79-3、aroA基因缺失株△aroA，同時挑取雞白痢沙門氏菌c79-3、△aroA分別接種于LB肉湯培養基中震搖過夜，次日分別轉接于40 ml的LB肉湯培養基中，調節初始OD600 nm均為0.05，37 ℃、180 r/min連續振蕩培養14 h，每隔1 h取出100 μL菌液測定OD600 nm的值，通過生長曲線繪制與平板上c79-3和△aroA的菌落大小同時判斷兩種菌株生長速度。

1.6 △aroA對雛雞的毒力試驗

將20只1日齡白來航雛雞隨機分為A、B兩組，分別接種雞白痢沙門菌株c79-3和△aroA菌株。A組10只，以3.4×107CFU的劑量口服接種c79-3；B組10只，以3.2×107CFU的劑量口服接種△aroA（兩組的活菌數由攻毒的菌液作活菌計數得到）。連續觀察2周，觀察小雞癥狀并統計死亡情況，從而評價菌株對雛雞的毒力。

2 結果與分析

2.1 雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株△aroA的鑒定

以質粒pKD3為模板，通過Aro1和Aro2引物，擴增出中間為氯霉素抗性基因，兩翼與aroA基因上下游序列同源的1 284 bp長同源臂DNA片段（圖1）。用aroA基因兩側特異性引物P1，P2擴增交換后的△aroA∶∶Cm基因組，以野生株c79-3基因組為對照，結果見圖2。以野生株c79-3為模板的擴增出了1 458 bp的條帶，而以△aroA∶∶Cm基因組為模板擴增出了1 302 bp的aroA基因同源臂和Cm抗性基因替換片段。用aroA基因內部特異性引物P3，P4擴增抗性片段消除后的△aroA基因組，以野生株c79-3基因組為對照，結果見圖3，以c79-3基因組為模板擴增出了大小為461 bp的部分aroA基因特異性條帶，而以△aroA基因組為模板未擴增出aroA基因特異性條帶。且以aroA基因兩側引物P1、P2擴增測序結果也進一步證實雞白痢沙門菌aroA基因缺失株△aroA構建成功。

2.2 △aroA的遺傳穩定性

分別以平板代傳代培養到第5、10、15、20的△aroA和c79-3的基因組為模板，通過aroA基因內部特異性引物P3、P4進行PCR擴增，測定△aroA的遺傳穩定性。由圖4可知，野生株c79-3的PCR產物點樣顯示出大小為461 bp的特異性條帶，而在傳代的△aroA菌株PCR產物中均沒有特異性條帶擴出。說明在傳至第20代時，aroA基因沒有回復，證明△aroA具有良好的遺傳穩定性。

2.3 △aroA的生長特性

LB劃線培養的c79-3和△aroA生長速度有差異，同時劃線培養的野生株在LB平板上菌落明顯大于aroA基因缺失株（圖5），生長曲線顯示，在初始的8 h內野生株和aroA基因缺失株生長速度基本一致，在8 h之后野生株生長速度大于缺失株，說明aroA基因的缺失影響雞白痢沙門菌c79-3的生長（圖6）。

2.4 △aroA對雛雞的毒力試驗

A組攻毒c79-3的10只雛雞在第四天死亡4只，死亡率為40%，雛雞出現萎靡，下痢等癥狀；B組攻毒△aroA的10只雛雞未發生死亡（圖7），癥狀較A組輕，說明aroA基因缺失后，其毒性發生下降。

3 討論

本試驗利用λ-red同源重組技術構建了雞白痢沙門氏菌株c79-3的aroA基因缺失株△aroA。生長特性鑒定結果表明，aroA基因缺失后在LB平板上生長速度變慢，同時接種的aroA缺失株菌落明顯小于野生株，需20 h方可見明顯單菌落。在LB肉湯里生長測定生長曲線時，前8 h通過OD600 nm判斷野生株和缺失株生長速度沒有差異，在8 h后野生株生長速度超過aroA基因缺失株。推測平板劃線結果與生長曲線測定前期有差異可能是在平板上生長時初期菌落較小，肉眼無法辨別出差異有關，后期隨著菌落繼續生長，出現了野生株菌落大于缺失株，與生長曲線結果相一致。aroA編碼5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化芳香族氨基酸的合成，參與代謝途徑過程[11-12]，其生長特性變慢可能是由于aroA基因的缺失導致芳香族氨基酸合成受阻，影響了細菌的生長。毒力試驗結果表明，aroA基因缺失后，雞白痢沙門菌對雛雞的的致病性顯著下降，推測由于aroA基因的缺失，雞白痢沙門氏菌的生長與環境適應能力受限，從而使得菌株的毒力下降。

隨著分子克隆技術越來越成熟，由aroA缺失導致的芳香族氨基酸營養缺陷得到越來越多的關注。Malcova[13]在腸炎沙門氏菌、Sebkova[14]在腸炎、鼠傷寒沙門氏菌上構建aro基因的缺失弱毒苗，結果表明芳香族氨基酸合成相關基因的阻斷獲得的減毒菌株在雞、小鼠等動物體上使用能獲得較好的免疫保護效果。本試驗以強毒株C79-3為親本，通過λ-red同源重組系統成功構建了雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株，致病性相比親本株有明顯下降，然而后期試驗顯示高劑量感染突變菌株仍能造成少量雛雞死亡。楊林等[15]的研究顯示不同親本菌株缺失aroA基因后致病性的下降程度具有一定的差異，本試驗構建的aroA缺失株并未完全喪失致病性，可能與本試驗所用的親本株毒力較強有關。可見單獨缺失雞白痢沙門氏菌強毒菌株c79-3的aroA基因，其致弱效果還未達到弱毒疫苗的要求，可以在保持較好免疫原性的前提上，嘗試在△aroA基礎上繼續缺失其它營養性基因或毒力基因，獲得具有更高免疫原性的減毒活疫苗候選株。本試驗為下一步研究雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株的功能和基于aroA基因缺失的雞白痢沙門氏菌減毒活疫苗奠定了基礎。

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