鋱離子增敏熒光光度法測定魚肉組織中的恩諾沙星殘留

任乃林+李紅

摘要： 為了研究建立分析測定恩諾沙星的新方法，以鋱-恩諾沙星配合物的熒光特性為基礎，發(fā)現(xiàn)在pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，鋱與恩諾沙星的配合物在545 nm（λex=328 nm）處產(chǎn)生了Tb3+的特征熒光峰，可用于恩諾沙星的分析測定，從而建立了簡單、快速、靈敏測定恩諾沙星的熒光方法，并優(yōu)選了反應的最佳條件。在最佳試驗條件下，恩諾沙星濃度在1.0×10-8～1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與其545 nm的熒光強度呈良好的線性關系（r2=0.992 3），檢出限為1.3×10-9 g/mL；對藥片中恩諾沙星的測定回收率為97.7%，變異系數(shù)為1.4%；對于魚肉組織中恩諾沙星測定回收率為79.0%～94.5%，變異系數(shù)為2.0%～7.8%。

關鍵詞： 增敏熒光分光光度法；恩諾沙星；鋱（Ⅲ）；藥片；魚肉殘留檢測；新方法

中圖分類號： S912 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0294-03

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）別稱乙基環(huán)丙沙星，是第3代氟喹諾酮類抗菌藥，為動物專用抗菌素，因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、生物利用度高、毒副作用小等優(yōu)點而受到國內(nèi)外臨床獸醫(yī)的關注，在臨床上已被廣泛應用。恩諾沙星為廣譜抗菌藥，對大腸桿菌、沙門氏桿菌、嗜血桿菌、巴氏桿菌等革蘭氏陰性菌有很強的抗菌作用[1]；此外，對革蘭氏陽性菌亦表現(xiàn)出良好的抗菌作用。恩諾沙星主要用于治療豬、雞、鵝、牛等的細菌性感染，同時用于治療繼發(fā)性感染和豬、雞的霉形體病。但是長期用藥所產(chǎn)生的不良反應、在畜禽產(chǎn)品中的殘留、耐藥性的增加以及在環(huán)境中的生態(tài)效應等已經(jīng)引起廣泛的關注，農(nóng)業(yè)部也制定了相關殘留限量標準。

國內(nèi)外關于恩諾沙星的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-6]、高效毛細管電泳法（HPCE）[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]、化學發(fā)光分析法[11-12]和熒光光譜法[13]等。

從化學結(jié)構(gòu)看，恩諾沙星藥物與其同類藥物類似，其核心部分為喹啉，具有較大的共軛結(jié)構(gòu)和剛性平面結(jié)構(gòu)，因此可產(chǎn)生較顯著的熒光，適合采用熒光光度法測定。

稀土離子Tb3+是靈敏的熒光探針，被廣泛用于藥物、蛋白質(zhì)、核酸等測定和研究，利用稀土Tb3+作為熒光探針測定喹諾酮類藥物已見報道[14-16]，如周靜等研究了鋱-培氟沙星的熒光特性[16]。本研究主要探討了ENR與Tb3+離子配合物體系的熒光特性，發(fā)現(xiàn)ENR與Tb3+離子能形成穩(wěn)定的配合物，能夠發(fā)射鋱離子的特征譜線[16]，由此建立1種簡單、快速、可靠的檢測藥物中恩諾沙星含量的方法，并用于實際樣品魚肉組織中恩諾沙星殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RF-5301型熒光分光光度計（日本島津分析儀器公司）；pHS-3D型pH計（上海雷磁儀器廠）。

主要試劑有：恩諾沙星標準儲備液（1 mg/mL）：準確稱取恩諾沙星標準對照品，用適量蒸餾水溶解，配成濃度為 1.0 mg/mL 貯備液；2 mol/L HAc溶液；HAc-NaAc緩沖溶液：取50 mL 2 mol/LHAc溶液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至所需pH值，定容至100 mL；Tb3+標準溶液（20 mmol/L）：準確稱取Tb4O7粉末0.373 8 g于燒杯中，逐漸加入適量的濃鹽酸，用電熱套加熱，保持微沸使其溶解，溶解后繼續(xù)加熱至蒸發(fā)結(jié)晶，再用0.1mol/L稀鹽酸溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容，用時稀釋到所需濃度。

熒光測定均在室溫進行，所有化學試劑除特別注明外均為分析純試劑，試驗用水為2次蒸餾水。

1.2 試驗方法

在10 mL的比色管中，分別加入適量的恩諾沙星標準儲備液，再依次加入一定量的20 mmol/L Tb3+溶液、1.0 mL HAc-NaAc 緩沖溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，振蕩均勻后放置20 min。

熒光光度法的測定：在室溫條件下，用1 cm石英比色皿裝入測量溶液，置于RF-5301型熒光分光光度計中，分別進行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描 （激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為350～700 nm），確定測定體系的最大熒光激發(fā)波長、最大熒光發(fā)射波長。試驗中采用固定激發(fā)波長、發(fā)射波長的方法測定相應條件下測試溶液的相對熒光強度。

片劑中恩諾沙星的測定：取2片恩諾沙星片劑樣品（規(guī)格為0.1 g ∶ 5 mg），精確稱量后研細，準確稱取1片量的藥粉，用蒸餾水溶解，待藥物完全溶解后過濾不溶物，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。取適量在最佳試驗條件下測定其相對熒光強度，計算恩諾沙星含量。

魚肉樣品中恩諾沙星的測定：隨機于市場購置多寶魚、鯽魚、羅非魚樣品，去鱗、內(nèi)臟組織，取其食用部分絞碎混勻。準確稱取5.00 g混勻魚肌肉組織樣，加入5.0 g無水硫酸鈉研磨均勻后置于10 mL離心管中，加入提取溶劑 （4 mL乙腈、0.04 mL 冰乙酸 ），高速勻漿2 min，于3 000 r/min離心6 min，移取上層清液；將殘渣重復提取1次，合并上層清液，用氮氣吹干，再用2.0 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液溶解殘渣，并稀釋至25.00 mL，取6份2.0 mL該樣品液，加入不同濃度的標準ENR溶液，采用標準加入法測定其中的ENR含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

準確量取10 μL濃度為1 mg/mL的恩諾沙星標準儲備液于10 mL比色管中，加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，進行光譜掃描，結(jié)果見圖1。可以看出：恩諾沙星的最大激發(fā)波長為328 nm，最大發(fā)射波長為435 nm。

在上述體系中加入Tb3+，恩諾沙星的激發(fā)光譜明顯下降（圖1中B線）；同時由于配合物的形成，發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，435 nm處恩諾沙星本身的熒光發(fā)射峰降低，同時在489、545、582、620 nm出現(xiàn)Tb3+的特征發(fā)射峰（圖1中B1線）。為了后續(xù)的研究，本試驗中如果選擇激發(fā)波長為275 nm時，在發(fā)射光譜550 nm附近會出現(xiàn)倍頻峰，將對Tb3+在545 nm附近的特征峰形成干擾，因此最后選擇激發(fā)波長為328 nm。

2.2 酸度對ENR-Tb（Ⅲ）熒光強度的影響

在pH值為3.5～13.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，觀察ENR-Tb3+配合物的熒光光譜變化。結(jié)果表明，在強堿性環(huán)境下（pH值>10）及強酸性環(huán)境下（pH值<3.5），ENR與Tb3+配合物不穩(wěn)定，沒有Tb3+的熒光發(fā)射；pH值為3.5～9.0范圍內(nèi)，均可觀察到Tb3+的熒光發(fā)射，545 nm的熒光強度隨pH值的變化情況見圖2；當pH值=6.0時，能得到最為明顯的鋱離子的特征峰，545nm的熒光強度最大，試驗選用的 HAc-NaAc緩沖溶液pH值=6.0作為配合物形成最佳酸堿度。

2.3 Tb3+濃度對鋱離子的特征熒光強度的影響

本試驗固定ENR的濃度為1.0 μg/mL，HAc-NaAc緩沖溶液的pH值=6.0，通過改變鋱離子的濃度，觀察其熒光光譜的變化。從結(jié)果看出，隨著鋱離子濃度增加，在545 nm處鋱離子的特征熒光強度逐漸增大（圖3）；當Tb3+濃度為 125 mg/L 時，545 nm鋱離子的熒光強度達到最大值，說明在此條件下，能量轉(zhuǎn)移最好，因此后續(xù)試驗中固定Tb3+濃度為 125 mg/L。

2.4 線性范圍和檢出限

在最佳試驗條件下，配制ENR的系列溶液，按相應試驗方法分別測定在545 nm處的熒光強度。ENR濃度在1.0×10-8～1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與熒光強度呈良好的線性關系，其標準曲線的回歸方程為F=264.29C+27.586，r2=0.992 3[F為熒光強度；C為ENR濃度，mg/L]。在最佳條件下平行測定11次空白溶液，按國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）（3σ）規(guī)定的方法計算檢出限為1.3×10-9g/mL。對于5.0×10-8 g/mL的ENR溶液進行10次平行測定，相對標準偏差為2.0%。

2.5 樣品測定

2.5.1 片劑中恩諾沙星的測定 取適量該樣品液并用“1.2”節(jié)方法平行測定5次，代入線性方程，計算得每片恩諾沙星平均含量為4.9 mg，結(jié)果與標示量基本相符（表1）。

2.5.2 恩諾沙星的回收率 在3支盛有樣品液的10 mL比色管中分別加入1.0 mg/mL恩諾沙星標準液，然后再加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液，再加入1.25 mL 1.0 mg/mL Tb3+溶液，按試驗方法分別測定在545 nm處的熒光強度，測定結(jié)果見表2，平均回收率為97.7%。

2.5.3 魚肉樣品的分析 按“1.2”節(jié)方法對魚肉樣品進行測定。結(jié)果表明，本次抽取的魚肉樣品均未檢出ENR殘留。試驗采用標準加入法測定加標回收率，結(jié)果見表3。方法的平均回收率在79.0%～94.5%之間，變異系數(shù)在10%以內(nèi)，達到了國際殘留法規(guī)委員會的要求。

3 結(jié)論

恩諾沙星與Tb3+能形成配合物發(fā)射鋱離子的特征熒光，由此建立了1個測定ENR的新方法，本方法用于實際樣品（恩諾沙星片劑和魚肉組織）中ENR的測定，方法快速，操作簡便，樣品回收率均在70%以上，變異系數(shù)在10%以內(nèi)，達到了國際殘留法規(guī)委員會的要求，可作為檢測ENR殘留的快速篩選方法。

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