酸性α—淀粉酶菌種的誘變選育

郭宏文+王艷+江成英+郭建華

摘要： 以從黑龍江省齊齊哈爾市北大倉酒廠白酒酒醅中分離篩選到的產酸性α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株C6為出發菌，利用紫外線、硫酸二乙酯作為誘變劑對其進行了復合誘變，制作致死率曲線確定誘變劑量，紫外線誘變照射時間為40 s，硫酸二乙酯誘變處理時間為20 min。通過初篩、復篩發酵，從大量的突變株中篩選到1株產酸性α-淀粉酶活力較高的菌株F21，在pH值為4.6條件下，α-淀粉酶活力達996.2 U/mL，比原菌株提高了2.56倍。產酶穩定性試驗表明，菌株F21產酶能力穩定，可以作為酸性α-淀粉酶育種研究的良好菌株。

關鍵詞： 酸性α-淀粉酶；紫外線誘變；硫酸二乙酯誘變；突變株

中圖分類號： Q933 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0356-02

我國是農業大國，淀粉產量高，淀粉深加工業發展前景十分廣闊。酸性α-淀粉酶是一種能夠在較低的pH值環境下液化淀粉的酶類，被廣泛應用在發酵、食品、紡織、飼料、醫藥等領域，開發新型的酸性α-淀粉酶具有較好的經濟效益和社會效益。自1963年日本學者Minoda等發現了黑曲霉可以用于生產耐酸性α-淀粉酶[1]以來，許多國家對酸性 α- 淀粉酶開展了研究。我國學者從20世紀90年代開始對酸性 α-淀粉酶進行研究，近年來相關研究主要集中在基因工程菌構建、菌種選育等方面[2-5]。為了得到優良的生產菌種，從自然界篩選及進行誘變選育仍是目前工業微生物育種的有效手段。筆者以從黑龍江省齊齊哈爾市北大倉酒廠白酒酒醅中篩選到的產酸性α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株C6為研究對象[6]，通過紫外線和硫酸二乙酯復合誘變，獲得產酶能力強的酸性α-淀粉酶突變株，旨在為開發利用酸性α-淀粉酶資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C6分離自白酒酒醅。平板篩選培養基：可溶性淀粉 10 g，蛋白胨5 g，Na2HPO4 0.1 g，KH2PO4 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。產酶種子培養基：可溶性淀粉 12 g，蛋白胨8 g，酵母粉2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。產酶發酵培養基：可溶性淀粉15 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2 主要試劑及儀器

試驗用硫酸二乙酯等試劑均為分析純。TU-1810紫外可見光分光光度計（普析通用公司）；紫外誘變箱，自制；Hermle高速冷凍離心機（德國哈默公司）；RH-Q恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；SYQ-DSX-280壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.3 紫外誘變處理

在紫外誘變箱內進行誘變，菌懸液距離15 W紫外燈 30 cm，磁力攪拌同時照射不同的時間，對處理液進行稀釋后涂布于平板篩選培養基，放在32 ℃培養箱內避光培養1～2 d。通過對平板菌落計數計算致死率，選定最佳誘變劑量進行誘變。

1.4 硫酸二乙酯（DES）誘變處理

三角瓶中分別加入磷酸緩沖液15 mL、待處理菌懸液 5 mL 及硫酸二乙酯溶液0.2 mL，置于36 ℃振蕩器內處理不同時間。取出1 mL處理液，加入1 mL 25% 硫代硫酸鈉溶液終止反應。將處理液稀釋后涂布于平板篩選培養基，放在 32 ℃ 培養箱內避光培養1～2 d。通過對平板菌落計數計算出致死率，確定最佳誘變劑量并進行誘變[7]。

1.5 突變株初篩

用稀碘液對分離平板上生長的菌落顯色，計算菌落透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d值），選出比出發菌株的D/d值增加10%以上的菌株，初步認為其發生了正突變，挑至斜面保存。

1.6 液態發酵

250 mL三角瓶中裝有25 mL種子培養基，接種后置于 36 ℃ 搖床中180 r/min振蕩培養18 h，取出2 mL種子培養液轉接到裝有25 mL發酵培養基的三角瓶中，置于36 ℃搖床中180 r/min振蕩培養48 h，發酵液用4層紗布過濾，測定濾液酶活力。

1.7 酶活力的測定

參照Yoo等的改良法[8-9] 進行酶活力的測定。

2 結果與分析

2.1 紫外誘變劑量的確定

由圖1可以看出，隨著照射時間的延長，紫外線誘變致死率逐漸增加。照射40、60、100 s的致死率分別為75.9%、91.3%、100%。依據誘變育種產量變異中多傾向于使用較低劑量的原則，本試驗選取致死率為70%～80%的誘變劑量，確定用紫外線照射時間為40 s的劑量進行誘變處理。

2.2 硫酸二乙酯誘變劑量的確定

由圖2可以看出，隨著處理時間的延長，DES誘變致死率逐漸增加。處理時間為20、30、50 min時致死率分別為 78.6%、88.7%、100%。本試驗選用致死率為70%～80%的誘變劑量，確定硫酸二乙酯誘變的處理時間為20 min。

2.3 紫外線誘變篩選結果

對出發菌株進行了多次紫外線誘變，通過初篩的方法選出了100株突變株，對它們進行發酵試驗測定其產酶能力，結果表明，65株突變株的酶活比原出發菌株有所提高，從中篩選出1株酶活力高且產酶穩定的突變株A1，酶活力達到 688.5 U/mL，比出發菌株C6提高了1.77倍。突變株的菌落形態及顏色與誘變前的出發菌株一致。

2.4 硫酸二乙酯誘變篩選結果

對紫外誘變篩選出的突變株A1進行了多次DES誘變，通過初篩選出了150株突變株，對它們進行發酵試驗測定其產酶能力，其中有72株突變株酶活比A1有所提高，產酶能力高的5株突變株分別為E32、F21、E8、F17、F61，酶活依次為1 053.1、997.1、932.2、906.3、876.1 U/mL，突變株E32的酶活比出發菌株A1提高了1.53倍。這些突變株的菌落形態及顏色與誘變前的出發菌株一致。

2.5 突變株的產酶穩定性結果

將酶活最高的E32等5株突變株連續傳代9次，用第1、3、5、7、9代菌株發酵產酶，測定酶活力，數據見表1。由表1可知，突變株E32、E8、F17、F61的產酶能力不穩定，隨著代數增加均有所下降，突變株F21的產酶能力穩定?？梢赃x用突變株F21用作以后發酵產酶的出發菌株。

3 結論與討論

本研究結果表明，出發菌株C6對紫外線及硫酸二乙酯的處理均比較敏感，容易產生突變及死亡。紫外誘變的效果好于硫酸二乙酯誘變。針對產酸性α-淀粉酶的菌株C6進行了復合誘變處理，效果良好，出發菌株C6的酶活為 389.2 U/mL，誘變篩選到的突變株F21的酶活達到996.2 U/mL，比誘變前提高了1.56倍。本試驗結果為今后進一步選育酸性α-淀粉酶的高產菌株打下了良好基礎。

參考文獻：

[1]Minoda Y，Arai M，Torigoe Y. Acid-stable α-amylase of black aspergilli Part Ⅱ[J]. Agr Biol Chem，1968，32（1）：104-109.

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[3]魏 濤，孫 浩，申玉龍，等. Sulfolobus tokodaii strain 7高溫酸性α-淀粉酶基因在大腸桿菌中克隆表達及其酶學性質[J]. 食品與發酵工業，2013，39（5）：13-17.

[4]王建玲，陳志鑫，劉逸寒，等. 產耐酸性α-淀粉酶菌株的分離、鑒定、酶學特性研究及發酵培養基的優化[J]. 生物技術通報，2014（4）：159-163.

[5]黃 偉，劉永樂，王發祥，等. 原生質誘變選育高產酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株[J]. 食品工業科技，2014，35（3）：160-162，167.

[6]郭宏文，郭建華，鄒東恢. 酸性α-淀粉酶產生菌的篩選[J]. 江蘇農業科學，2013，41（12）：360-361，362.

[7]杜連祥. 工業微生物學實驗技術[M]. 天津：天津科學技術出版社，1992：185.

[8]Yoo Y J，Hong J，Hatch R T. Comparison of α-amylase activities from different assay methods[J]. Biotechnology and Bioengineering，1987，30（1）：147-151.

[9]史永昶，姜涌明，樊 飚，等. 蛋白酶對解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶活力的影響.[J]. 微生物學通報，1995，22（1）：23-25.