氟樂靈降解菌株的分離鑒定及降解特性研究

季麗+吳偉

摘要： 分離篩選出1株能高效降解養(yǎng)殖水體中氟樂靈的微生物菌株FJ-01，經(jīng)生理生化和序列同源性分析，將該菌株鑒定為Leucobacter菌。結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖的實(shí)際情況，該菌降解氟樂靈的最適pH值為6.0～8.5，最適溫度為22～30 ℃，最佳光照條件為光暗比12 h∶ 12 h，最佳接種量為0.01%，氟樂靈的初始濃度0.05 mg/L。

關(guān)鍵詞： 氟樂靈；生物降解；16S rDNA；Leucobacter菌；降解特性

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0390-04

氟樂靈（trifluralin），別稱氟樂寧、氟特力、茄科寧等，化學(xué)名稱為2，6-二硝基-N，N-二丙基-4-三氟甲基苯胺，分子式C13H16F3N3O4。實(shí)際生產(chǎn)中氟樂靈的常用劑為48%的乳油制品，是一種廣泛應(yīng)用的二硝基苯胺類選擇性芽前除草劑。因其在蝦蟹育苗及養(yǎng)殖過程中可治療和預(yù)防真菌病（鏈壺菌病）[1]且具滅苔不傷草的功效，也廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

然而有研究表明，氟樂靈可使受試動(dòng)物發(fā)生癌變、染色體突變并對(duì)哺乳動(dòng)物具有基因毒性[2-4]。氟樂靈對(duì)哺乳動(dòng)物、蝦、蟹、鳥類的毒性較低，但對(duì)魚類的毒性很大[5]。針對(duì)氟樂靈的使用情況和有關(guān)毒理學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，2004年11月底，美國環(huán)保署再次修訂氟樂靈最高殘留限量[6]，重新修訂后為 0.05 mg/kg。2010年日本多次檢出我國出口的鰻魚、梭子蟹等水產(chǎn)品中氟樂靈超標(biāo)，對(duì)我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)造成一定影響。

利用微生物來降解農(nóng)藥最早報(bào)道于1951年，當(dāng)時(shí) Audus[7]研究了土壤微生物對(duì)2，4-D的降解，引發(fā)了世人對(duì)微生物降解能力的關(guān)注。微生物降解技術(shù)相對(duì)于物理、化學(xué)技術(shù)，具有高效、徹底、無二次污染和成本低等優(yōu)勢，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。

目前對(duì)于氟樂靈的研究主要著重于其對(duì)動(dòng)植物的影響，在土壤中的遷移、轉(zhuǎn)化、降解[8-10]以及檢測方法[11-13]。對(duì)于如何去除水環(huán)境和生物體內(nèi)的氟樂靈報(bào)道較少，因此篩選更多類型水體中的氟樂靈高效降解菌對(duì)于氟樂靈殘留的生物修復(fù)研究和應(yīng)用具有十分重要的意義。本研究從受污染池塘底泥中篩選到1株可降解低氟樂靈濃度的菌株，并研究其降解特性，以期為合理使用漁用藥物和保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 氟樂靈降解菌分離源

氟樂靈降解菌分離自江蘇宜興多年使用過氟樂靈的蝦蟹養(yǎng)殖池塘的底泥。采用柱狀采泥器采集5個(gè)不同的池塘底泥各500 g，裝入無菌的玻璃廣口瓶中，4 ℃保存下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

菌株富集所用的培養(yǎng)基（葡萄糖1 g、蛋白胨10 g、硝酸銨0.2 g、酵母膏0.06 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鈉1 g、水1 L），pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

菌株馴化培養(yǎng)所采用的無碳源培養(yǎng)基（硝酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鈉1 g、水1 L），pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

菌株保存培養(yǎng)基采用液體或固體的肉湯培養(yǎng)基[牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g（固體需加瓊脂20 g）、蒸餾水1 L]，pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3 氟樂靈降解菌株的篩選、分離和純化

無菌條件下取養(yǎng)殖池塘的底泥1 g，置于經(jīng)滅菌冷卻的99 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩48 h培養(yǎng)。將經(jīng)富集培養(yǎng)后的底泥懸濁液靜置0.5 h，在無菌條件下取1 mL上清液于99 mL富集培養(yǎng)基中按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取10 mL經(jīng)培養(yǎng)所得的菌液于250 mL無碳源培養(yǎng)基（含 0.01 mg/L 氟樂靈）中，培養(yǎng)（條件均為30 ℃、150 r/min）48 h后將菌液轉(zhuǎn)接至下一批次新的無碳源培養(yǎng)基中，并逐步加大無碳源培養(yǎng)基中氟樂靈的濃度，從0.01 mg/L提高至 2.0 mg/L。每次轉(zhuǎn)接前需測定培養(yǎng)液中氟樂靈的實(shí)際含量，濃度有明顯下降則表明培養(yǎng)液中有降解菌株的存在。

將混合培養(yǎng)物經(jīng)含2.0 mg/L氟樂靈的無碳源培養(yǎng)基平板涂布，并將其進(jìn)行分離化，取最終的馴化培養(yǎng)液1 mL于 9 mL 無菌水中，得到10-1的稀釋度，并依次獲得10-2和10-3的稀釋度。從3個(gè)不同的稀釋度中取樣，在含2.0 mg/L氟樂靈的無碳源培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布分離，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。選擇菌落疏密適當(dāng)?shù)钠桨澹陲@微鏡下觀察，挑取生長狀況良好、形態(tài)不同的菌落于液體肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將分離所得的各菌株在平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接、傳代5次，選擇其中能在含氟樂靈無碳源培養(yǎng)基上生長的菌株，轉(zhuǎn)接至試管斜面，于4 ℃冰箱保存。

將純化得到的菌株用肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌數(shù)為 109 CFU/mL 水平，按5%的比例接種于250 mL裝有100 mL 0.5 mg/L氟樂靈無碳源培養(yǎng)基的三角瓶中，放置振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。每隔24 h取樣1次，經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定D600 nm，做3個(gè)平行，分別以培養(yǎng)時(shí)間、D600 nm吸光值為橫、縱坐標(biāo)繪制菌株的生長曲線。同時(shí)測定其中氟樂靈的濃度，選擇降解率和生長性能均較好的菌株作為最終的目標(biāo)菌株，進(jìn)行鑒定和降解特性的研究。

1.4 氟樂靈降解率的分析測定

菌株分離篩選時(shí)，氟樂靈的測定采用氣相色譜（GC）法，其中色譜條件的選擇參照文獻(xiàn)[14]。取培養(yǎng)液50 mL于 250 mL 分液漏斗中，加入色譜純二氯甲烷10 mL，搖振萃取 5 min，靜置分層，取有機(jī)溶劑層，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，棄殘余水相。有機(jī)相在氮?dú)庀麓蹈桑儆枚燃淄槎ㄈ葜?1 mL，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后進(jìn)氣相色譜分析。

氟樂靈的降解率=（Ct-C0）/C0×100%。

式中：Ct為培養(yǎng)液中氟樂靈的最終濃度， mg/L；C0 為培養(yǎng)液中氟樂靈的初始濃度， mg/L。

1.5 氟樂靈降解菌株的16S rDNA的分析

為進(jìn)一步確定所選菌株的種屬，在進(jìn)行菌落形態(tài)觀察的同時(shí)采用16S rDNA方法鑒定菌株。按SK8255（細(xì)菌）試劑盒的操作程度提取菌株的DNA，使用細(xì)菌通用引物7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540 r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）擴(kuò)增其片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察（1%瓊脂糖電泳，150 V 100 mA，20 min），并由生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行測序，所得基因序列經(jīng)Blast程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，采用MEGA 5.1軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.6 氟樂靈降解菌株的生長曲線及降解特性

在2 500 mL三角瓶中加入1 000 mL的養(yǎng)殖水體水樣（水質(zhì)COD為17.75 mg/L，TN為1.6 mg/L，TP為0.30 mg/L，NH+4-N為0.70 mg/L，NO-3-N為0.15 mg/L，NO-2-N為0.10 mg/L，pH值為7.0），經(jīng)滅菌冷卻后根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)的實(shí)際情況和條件加入氟樂靈并接入一定量的培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌液（菌液濃度1×109 CFU/mL），研究在不同的溫度（15、22、30 ℃）、pH值（6.0、7.0、8.5）、光暗比（4 h ∶ 20 h、12 h ∶ 12 h、20 h ∶ 4 h）、接種量（1%、0.1%、0.01%）和氟樂靈濃度（0.01、0.05、0.5、1.0、2.0 mg/L）下，菌株經(jīng)5 d連續(xù)作用后對(duì)氟樂靈的降解能力；試驗(yàn)設(shè)3組平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟樂靈降解菌株的分離、篩選和純化

以江蘇宜興多次使用過氟樂靈的5個(gè)蝦蟹養(yǎng)殖池塘底泥（S1～S5）為分離源，采用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得混合菌源。將混合菌源接入含0.01～2.0 mg/L氟樂靈的無碳培養(yǎng)基中，經(jīng)30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，分析培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中氟樂靈的降解情況，以判別降解菌的存在和選擇適宜的分離源。試驗(yàn)結(jié)果詳見圖1。

由圖1可知，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，因揮發(fā)等因素的影響，對(duì)照組CK的氟樂靈（0.01～2.0 mg/L）有5.31%～25.08%的去除率，且隨著濃度的上升而增大。相對(duì)于對(duì)照組，富集于S1、S2池塘底泥的菌源，其對(duì)氟樂靈的降解效果不顯著（P>0.05），而富集于S3～S5池塘底泥的菌源則具有良好的降解效率。其中S4的菌源對(duì)于0.05 mg/L以上的氟樂靈降解效果尤其顯著（P<0.05），扣除對(duì)照組本底變化值后分別達(dá)到11.31%、12.48%、12.56%、17.54%和 13.12%。因此降解氟樂靈的菌株重點(diǎn)在S3～S5池塘底泥的菌源中篩選。

將S3～S5這3組的菌株培養(yǎng)物在無菌條件下，經(jīng)含氟樂靈2.0 mg/L的無碳源培養(yǎng)基平板進(jìn)行涂布和分離純化，共獲得菌株7株，編號(hào)為FJ-01～FJ-07。將這7株菌株對(duì) 0.5 mg/L 的氟樂靈進(jìn)行5 d的降解，降解結(jié)果見圖2。由圖2可知，在所篩選出的7株菌株中，5 d內(nèi)對(duì)0.5 mg/L氟樂靈降解效果較好的有4株菌，分別為FJ-01、FJ-02、FJ-06和FJ-07，降解率大于76%（扣除對(duì)照組本底后大于55%），其中FJ-01菌株的降解率最高，達(dá)84.1%（扣除對(duì)照組本底后為64.6%）。

試驗(yàn)同時(shí)測定了4株具有較好降解作用菌株的生長曲線。由圖3可知，4株菌在含0.5 mg/L氟樂靈的無碳培養(yǎng)基中生長良好。相比較而言，F(xiàn)J-01菌株的生長比較活躍，是唯一D值超過1.0的菌株，因此將其作為降解的首選菌株進(jìn)行研究和探索。

2.2 氟樂靈降解菌株FJ-01的菌落形態(tài)觀察和16S rDNA分析

所篩得的氟樂靈降解菌FJ-01在固體肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌落圓形且呈乳白色或淡黃色，四周邊緣較為光滑，表面濕潤，不易挑取，革蘭氏染色呈陽性（圖4）。

以FJ-01菌株的基因組DNA為模板，利用引物7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540 r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）對(duì)FJ-01菌16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5。其中右側(cè)第1個(gè)條帶為FJ-01菌16S rDNA的擴(kuò)增片段，左側(cè)為對(duì)比條帶marker。從該圖的凝膠成像圖可以看出，PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 500 bp，符合16S rDNA的片段大小。

FJ-01的16S rDNA序列在NCBI上比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)其與多株Leucobacter菌的16S rDNA相似，調(diào)出其中相似度較高的Leucobacter菌 16S rDNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)計(jì)算，菌株FJ-01與Leucobacteralbus strain IAM 14851距離最近，兩者同源性為91%，可以判斷FJ-01菌株與Leucobacteralbus strain IAM 14 851為不同種，但同屬于Leucobacter屬。具體種仍待進(jìn)一步分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。

2.3 氟樂靈降解菌株FJ-01的降解特性研究

根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中氟樂靈使用的實(shí)際情況和條件，研究了不同的溫度、pH值、光暗比、接種量和氟樂靈初始濃度對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響，了解菌株FJ-01的降解特性。

2.3.1 氟樂靈初始濃度對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響 為考察氟樂靈初始濃度對(duì)菌株FJ-01降解的影響，試驗(yàn)根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的實(shí)際情況，選擇了0.01、0.05、0.5、1.0、20 mg/L 5個(gè)濃度。試驗(yàn)條件為：溫度30 ℃、水體pH值為7.0、光暗比為12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，試驗(yàn)時(shí)間為 5 d。試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

由圖7可以看出，當(dāng)其他條件一致時(shí)，經(jīng)過5 d的試驗(yàn)，5個(gè)濃度組的氟樂靈均有不同程度的降解：其中0.01 mg/L濃度組的降解率偏低，僅為17.46%，而其他各濃度組的氟樂靈降解較明顯，降解率均大于38%，其中0.05 mg/L組的降解效果最為顯著，達(dá)66.26%。5個(gè)濃度組中0.05、0.5、1.0 mg/L這3個(gè)濃度組的降解率較為接近。降解率的不同與濃度有直接的關(guān)系，0.01 mg/L組本身濃度偏低，可利用性差；而 2.0 mg/L 組濃度偏大，對(duì)菌株的生長代謝有一定的抑制作用，故降解率又會(huì)有一定的下降。0.05～1.0 mg/L 組的濃度處于菌株代謝的適宜范圍，而生產(chǎn)實(shí)際中氟樂靈的常用濃度是005 mg/L，因此該菌對(duì)養(yǎng)殖水體環(huán)境中殘留氟樂靈的降解是有效和適宜的。

2.3.2 溫度對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響 為考察水體溫度對(duì)菌株FJ-01降解的影響，試驗(yàn)根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的實(shí)際情況，選擇了水溫為15、22、30 ℃ 3個(gè)溫度。試驗(yàn)條件為：水體pH值7.0、光暗比12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗(yàn)時(shí)間為5 d，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

由圖8可以看出，相對(duì)于15 ℃時(shí)22.58%的降解率而言，22 ℃ 和30 ℃ 時(shí)FJ-01菌株對(duì)氟樂靈5 d的降解率分別達(dá)到51.62%和67.32%，表明溫度較高適宜氟樂靈的降解。一方面，水溫較高，特別是30 ℃左右時(shí)，正是微生物生長代謝的適宜溫度，有利于微生物對(duì)氟樂靈的代謝轉(zhuǎn)化；另一方面，水溫上升有利于氟樂靈的揮發(fā)，從而加快其去除。15 ℃的水溫較低，降解率也偏低，但此時(shí)一般不進(jìn)行養(yǎng)殖生產(chǎn)或雖然養(yǎng)殖但不需要使用氟樂靈，因此對(duì)實(shí)際應(yīng)用的影響不大。養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用氟樂靈主要在早春水溫22 ℃左右，用于殺滅水中的水綿，其次是在水溫30 ℃左右時(shí)防治蝦病。而這2個(gè)溫度條件下FJ-01菌株對(duì)氟樂靈有50%以上的降解率，故適宜在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

2.3.3 pH值對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響 為考察水體pH值對(duì)菌株FJ-01降解的影響，試驗(yàn)根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中實(shí)際情況，選擇了水體pH值為6.0、7.0、8.5的3個(gè)值。試驗(yàn)條件為：水溫30 ℃、光暗比12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗(yàn)時(shí)間為5 d，試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

從圖9可以看出，pH值為6.0、7.0、8.5時(shí)，菌株FJ-01降解氟樂靈無顯著差異，5 d后降解率分別為61.97%、66.26% 和68.05%，表明在pH值在6.0～8.5范圍內(nèi)，對(duì)菌株的降解能力無影響，且養(yǎng)殖水體的pH值基本在此范圍內(nèi)波動(dòng)，故對(duì)菌株FJ-01而言是適宜降解的條件。

2.3.4 光暗比對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響 為考察光暗比對(duì)菌株FJ-01降解的影響，試驗(yàn)根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的實(shí)際情況，選擇了光暗比為20 h ∶ 4 h、12 h ∶ 12 h、4 h ∶ 20 h（光照度為2 500 lx）3個(gè)水平。試驗(yàn)條件為：水溫30 ℃、pH值為 7.0、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗(yàn)時(shí)間為5 d，試驗(yàn)結(jié)果見圖10。

由圖10可以看出，在5 d的試驗(yàn)中，各組最終的降解率在63.93%～66.15%之間，并無顯著性差異，但5 d中的降解速率存在差異。光暗比為20 h ∶ 4 h、12 h ∶ 12 h的2組，在試驗(yàn)前2 d的降解速度明顯快于光暗比為4 h ∶ 20 h的試驗(yàn)組，且2 d的降解率分別為55.04%和51.79%，遠(yuǎn)大于光暗比為4 h ∶ 20 h試驗(yàn)組的39.32%。表明在試驗(yàn)開始后的2 d內(nèi)，菌株處于適應(yīng)并增殖狀態(tài)，氟樂靈的降解中包含了部分的光降解，若此時(shí)光照時(shí)間長，降解率會(huì)明顯提高。隨著微生物代謝能力的加劇，后3 d此種影響減弱，氟樂靈的代謝以菌株的代謝為主，最終的降解率趨于一致。

2.3.5 接種量對(duì)菌株FJ-01降解能力的影響 為考察菌株FJ-01接種量對(duì)降解效果的影響，試驗(yàn)根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的實(shí)際情況，選擇了接種量為1%、0.1%和0.01% 3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)條件為：水溫30 ℃、pH值為7.0、光暗比 12 h ∶ 12 h，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗(yàn)時(shí)間為5 d，試驗(yàn)結(jié)果見圖11。

由圖11可以看出，在5 d的試驗(yàn)中，各組最終的降解率在60.19%～62.41%之間，并無顯著性差異，但5 d中的降解效果存在差異。接種量為0.1%和1%的2組，試驗(yàn)前2 d的降解效率明顯要高，2 d的降解率分別為54.44%和 53.15%，遠(yuǎn)大于另一組的35.93%。表明在試驗(yàn)開始后的 2 d 內(nèi)，菌株處于適應(yīng)和增殖狀態(tài)，菌株活性菌數(shù)高的試驗(yàn)組降解能力明顯要強(qiáng)，但隨著菌體的代謝，從第3天起降解作用效果趨于一致。因此菌株的接種量以0.1%為佳，但在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用必須考慮經(jīng)濟(jì)有效性以及最終的降解結(jié)果，故接種量的選擇宜小不宜大，0.01%及以下的接種量則更加適宜，這還有待于在實(shí)際應(yīng)用中加以修正和完善。

3 小結(jié)

采用富集培養(yǎng)基和含氟樂靈的無碳源培養(yǎng)基從養(yǎng)殖池塘底泥中定向分離得到具有降解功能的4株菌株，菌株分別標(biāo)記為FJ-01、FJ-02、FJ-06和FJ-07。將此4菌株加入含有氟樂靈的無碳源培養(yǎng)基中，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)FJ-01菌株在培養(yǎng)液中生長情況最好，且對(duì)氟樂靈的降解率最高，故選擇FJ-01菌株作為重點(diǎn)研究菌株。

對(duì)菌株FJ-01進(jìn)行了純化和培養(yǎng)，分析了其菌落、菌株形態(tài)，提取了菌體DNA并進(jìn)行了16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增得到的目標(biāo)片段進(jìn)行測序。利用Blast對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，初步確定菌株FJ-01為Leucobacter sp.。

研究表明，結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖的實(shí)際情況，菌株FJ-01對(duì)氟樂靈降解的適宜條件為：pH值為6.0～8.5，水溫為22～30 ℃，光暗比為12 h ∶12 h，接種量為0.01%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L。

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