低產高級醇葡萄酒酵母菌株的篩選

劉學強，錢泓，周正，張翠英

(工業微生物教育部重點實驗窒，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

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低產高級醇葡萄酒酵母菌株的篩選

劉學強，錢泓，周正，張翠英*

(工業微生物教育部重點實驗窒，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

摘要分析了6株葡萄汁酵母(WY-1，WY-2，WY-3，WY-4，WY-5，WY-6)以及2株葡萄酒活性干酵母(VL1，QA23)的高級醇產生量，并利用杜氏管發酵比較各菌株的耐受性(包括耐乙醇、酸、高糖以及SO2)，通過葡萄酒發酵比較各菌株的生長、發酵性能。研究結果表明，WY-1高級醇產生量較低，為206.31 mg/L；且分別在乙醇體積分數為16%、pH為2.65、葡萄糖質量濃度為400 g/L以及SO2質量濃度為400 mg/L時都有很好的耐受性；生長速率較快、發酵性能較好，乙醇體積分數高于其他菌株，為11.01%。證明篩選出的WY-1為1株優良的低產高級醇葡萄酒酵母菌株。

關鍵詞葡萄酒酵母；高級醇；發酵性能；耐受性

葡萄酒是以葡萄為原料經酵母菌發酵釀制而成的一種具有較高營養價值的低酒精度飲料，人類利用酵母菌釀制葡萄酒已有數千年的歷史[1]。葡萄酒有優美的風味與獨特的色澤，乙醇含量低，適量飲用可增進食欲、緩解疲勞、促進血液循環、延緩人體衰老、預防冠心病、防癌抗癌等[2]。

高級醇是指3個碳原子以上的一元醇類，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇和苯乙醇等[3]。高級醇是葡萄酒發酵的主要副產物，酒呈味的主要成分，適量的高級醇可以賦予葡萄酒特殊的風味和香氣[4]。若葡萄酒中高級醇含量很少則酒體風味淡薄；但含量過高則會給葡萄酒帶來異味，并易使人頭疼和醉酒，因此必須控制葡萄酒中高級醇含量。

葡萄酒釀酒酵母在葡萄酒發酵過程中起至關重要的作用，它會產生許多微量易揮發代謝物，對葡萄酒的香氣、味道、口感和色澤影響重大，賦予葡萄酒特有的品質[5]。本文通過杜氏管發酵法對比本實驗室的保存的8株葡萄酒酵母菌株的耐受性，通過葡萄酒發酵對比8株酵母菌株的生長、發酵性能以及高級醇產生量，篩選出1株高級醇產生量較低且耐受性、生長性能、發酵性能較好的菌株[6]，為控制葡萄酒釀造過程中高級醇含量提供了優良的菌種。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1菌株

本實驗室保藏的6株葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)，分別編號為WY-1，WY-2，WY-3，WY-4，WY-5，WY-6以及2株葡萄酒活性干酵母VL1，QA23。無營養缺陷標記。

1.1.2培養基

YEPD培養基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L。pH自然，115℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄汁糖濃度為210 g/L。

1.1.3儀器及試劑

本實驗所用主要實驗儀器如表1。

表1　主要實驗儀器

1.2實驗方法

1.2.1葡萄酒酵母耐乙醇試驗[7]

分別取1.2，1.4和1.6 mL的無水乙醇對應加入到8.3，8.1，7.9 mL YEPD培養基中(內含杜氏管)，混勻，使乙醇體積分數分別為12%，14%，16%。按5%接種量接入各酵母的種子培養液0.5 mL到以上YEPD培養基中，25℃靜置培養。每個酵母菌株每個濃度做3個平行試驗。觀察產氣情況。

1.2.2葡萄酒酵母耐酸試驗

分別配制酒石酸質量濃度為20，30，40 g/L的YEPD 培養基(內含杜氏管)(pH分別為2.65，2.50，2.30)。按5%接種量接入各酵母的種子培養液0.5 mL到以上YEPD培養基中，25℃靜置培養。每個酵母菌株每個濃度做3個平行試驗。觀察產氣情況。

1.2.3葡萄酒酵母耐高糖試驗

分別配制葡萄糖濃度為200，300，400 g/L的YEPD 培養基(內含杜氏管)。按5%接種量接入各酵母的種子培養液0.5 mL到以上YEPD培養基中，25 ℃靜置培養。每個酵母菌株每個濃度做3個平行試驗。觀察產氣情況。

1.2.4葡萄酒酵母耐SO2試驗

將H2SO3稀釋為不同濃度，分別取1.0 mL到8.5 mL YEPD 培養基中(內含杜氏管)，混勻，使SO2含量分別為100，150，200 mg/L。按5%接種量接入各酵母的種子培養液0.5 mL到以上YEPD培養基中，25℃靜置培養。每個酵母菌株每個濃度做3個平行試驗。觀察產氣情況。

1.2.5葡萄酒發酵試驗

種子液培養：在各菌株斜面分別取1環菌泥于50 mL YEPD液體培養基中，25 ℃靜置培養36 h。

葡萄酒發酵：用葡萄糖調節葡萄汁初糖濃度至210 g/L，將種子培養液按5%接種量接入裝有180 mL葡萄汁的250 mL三角瓶中，25℃生化培養箱中發酵6 d，每隔24 h稱重并記錄。每個酵母菌株做3個平行試驗。

1.3分析方法

1.3.1生長曲線的測定

(1)在各菌株斜面分別取1環菌泥到裝有5 mL YEPD液體培養基的試管中，30 ℃下靜置培養12 h。

(2)取40 μL上述培養好的菌液接入裝有360 μL液體YEPD培養基的100孔板的孔中，將100孔板放置于全自動生長曲線測定儀中，30 ℃培養，每隔0.5 h測定600 nm 處的吸光值。

(3)以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.3.2發酵速率的測定

CO2失重法：發酵過程中每隔24 h稱重并記錄數據，計算發酵瓶累積失重量(即CO2的釋放量)。然后以發酵瓶累積失重為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線。

1.3.3乙醇體積分數的測定[8]

酒精比重計法。

1.3.4還原糖的測定[8]

斐林試劑法。

1.3.5游離酸的測定[8]

酸堿滴定法。

1.3.6總酯的測定[8]

皂化法。

1.3.7氣相色譜法測定高級醇[9]

采用氣相色譜法測定發酵結束后發酵液中高級醇含量，乙酸正丁酯作為內標。

(1)樣品預處理。取內標液0.1 mL置于10 mL容量瓶中，并用待測酒樣定容，混勻；過膜除雜質，取0.15 mL加入到自動進樣瓶中，然后進行氣相分析。

(2)色譜條件。氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動進樣器，色譜柱Agilent 1909N-213，30 m×0.32 mm×0.5 μm毛細血管柱，檢測器為FID。進樣口的溫度設置為200 ℃，檢測器的溫度為200 ℃。進樣量條件：1 μL的進樣量，并設置為5∶1的分流比。載氣為高純度的氮氣，流速設置為3.0 mL/min。升溫程序：起始柱溫設置為50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min的升溫速度上升至120℃，保持5 min。

2結果與討論

2.1葡萄酒酵母乙醇耐受性

在葡萄酒釀造過程中，酵母發酵產生乙醇，當乙醇達到一定濃度時便會停止發酵。所以，我們需要較高乙醇耐性的酵母菌株以保證發酵更完全、乙醇產率更高。由于大部分紅葡萄酒的乙醇體積分數在12%左右，一般不會超過16%[10]，據此設置乙醇濃度梯度為12%、14%、16%作為酵母乙醇耐受性的篩選標準。

按照方法1.2.1對各酵母菌株進行耐乙醇實驗，觀察產氣情況。氣泡產生時間越早，產氣泡越多，說明菌株的耐乙醇能力越強。試驗結果見表2。

由表2可以看出，從發酵5 h開始產生氣泡，6 h時各酵母菌株產氣情況開始有所不同，表明各菌株的耐受性存在一定差異。菌株WY-3自始自終產氣都很少，其對乙醇耐受性很低。菌株WY-1、WY-2、WY-4、WY-6和VL1在8 h時不同乙醇濃度下均有較大的產氣能力，說明它們對乙醇均有較高的耐受性。

表2　不同乙醇濃度下的產氣情況

注： “-”代表無氣泡產生；“+”、 “++”、 “+++”、 “++++”分別代表產生氣泡占杜氏管的1/4，1/2，3/4以及全部。

2.2葡萄酒酵母酸耐受性

葡萄酒釀造過程中pH范圍在3.0～4.0。設置酒石酸質量濃度梯度為20、30、40 g/L(對應pH分別為2.65、2.50、2.30)作為酵母酸耐受性的篩選標準[11]。

按照方法1.2.2對各酵母菌株進行耐酸實驗，觀察產氣情況。氣泡產生時間越早，產氣泡越多，說明菌株的耐酸能力越強。試驗結果見表3。

表3　不同酒石酸濃度下的產氣情況

注：“-”代表無氣泡產生；“+”、 “++”、 “+++”、 “++++”分別代表產生氣泡占杜氏管的1/4，1/2，3/4以及全部。

由表3可以看出，WY-3產氣最少，耐酸能力最差；QA23次之；其他菌株耐酸能力都很好。

2.3葡萄酒酵母高糖耐受性

葡萄酒發酵中一般要求葡萄汁的初始糖質量濃度不低于200 g/L。據此設置葡萄糖質量濃度梯度為200、300、400 g/L，作為酵母高糖耐受性的篩選標準[12]。

按照方法1.2.3對各酵母菌株進行耐高糖實驗，觀察產氣情況。氣泡產生時間越早，產氣泡越多，說明菌株的耐高糖能力越強，試驗結果見表4。

由表4可以看出，相對其他菌株而言，WY-3耐高糖能力較差；葡萄糖質量濃度為200 g/L時，菌株WY-1和WY-2在6 h便能正常生長產氣，其他菌株在8 h才能正常生長產氣；葡萄糖質量濃度為300 g/L時，各菌株在10 h均能正常生長產氣，差別不大； 當葡萄糖質量濃度為400 g/L時，菌株WY-1和WY-4能在12 h時正常生長產氣，而其他菌株產氣較少。綜上可知，菌株WY-1在不同葡萄糖質量濃度下耐高糖能力都很好。

表4　不同葡萄糖質量濃度下的產氣情況

注：“-”代表無氣泡產生；“+”、 “++”、 “+++”、 “++++”分別代表產生氣泡占杜氏管的1/4，1/2，3/4以及全部。

2.4葡萄酒酵母SO2耐受性

在葡萄酒釀造過程中添加的SO2一般在100 mg/L左右，但會根據葡萄品質、工藝等做出調整，一般不會超過200 mg/L。據此設置SO2質量濃度梯度為100，150，200 mg/L作為酵母SO2耐受性的篩選標準[10]。

按照方法1.2.4對各酵母菌株進行耐SO2實驗，觀察產氣情況。氣泡產生時間越早，產氣泡越多，說明菌株的耐SO2能力越強。試驗結果見表5。

表5　不同SO2質量濃度下的產氣情況

注：“-”代表無氣泡產生；“+”、 “++”、 “+++”、 “++++”分別代表產生氣泡占杜氏管的1/4，1/2，3/4以及全部。

由表5可以看出，菌株WY-3和QA23產氣能力較差，耐SO2能力較差；菌株WY-2、WY-5和VL1在6h才能正常生長產氣，耐SO2能力一般；菌株WY-1、WY-4、WY-6在5h便能正常生長產氣，耐SO2能力較好。

2.5各酵母菌株生長曲線

圖1　各酵母菌株生長曲線Fig.1　Growth curve of yeast strains

按照方法1.3.1對各菌株進行生長曲線的測定。由圖1可以看出，各菌株都經歷了延滯期、對數期和穩定期3個階段。菌株WY-3長勢最慢，菌株QA23次之；菌株WY-1等生長都較快且相差不大。

通過以上對酵母的耐受性試驗及其生長曲線的測定可知，菌株WY-3對乙醇、酸、高糖和SO2的耐受性均很差且生長最為緩慢；菌株QA23對酸和SO2的耐受性較差且生長也較為緩慢。故可以先篩除菌株WY-3和QA23，其他菌株繼續做葡萄酒發酵試驗以比較各菌株發酵性能及高級醇產生量。

2.6葡萄酒發酵

2.6.1發酵速率

發酵過程中每隔24 h稱重并記錄數據，計算CO2累積失重量(即發酵瓶累積失重量)。然后以CO2累積失重為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線(如圖2)。

由圖2知：菌株WY-6發酵速率遠慢于其他菌株；其他菌株中，WY-2發酵速率相對較慢，WY-1和WY-4發酵速率相對較快，但相差不大。

2.6.2發酵性能

圖2　各酵母菌株的發酵速率Fig.2　Fermentation speed of yeast strains

按方法1.2.5進行葡萄酒發酵試驗。發酵結束后測定各菌株發酵葡萄酒殘糖、乙醇度、游離酸及總酯含量，結果如表6。

表6　各酵母菌株的發酵性能

從表6可看出，各菌株殘糖含量都比較低，說明都能進行正常的發酵；其中WY-1的殘糖最低，為1.28 g/L，發酵最完全；各菌株乙醇度相差不大，以WY-1的乙醇體積分數最高，為11.01%，已經充分地將葡萄糖轉化為乙醇；各菌株的游離酸相差不大；WY-1的總酯含量為0.29 g/L，為幾株菌株中最高，酯類是葡萄酒中的重要風味物質，較多的酯類有助于提高葡萄酒的風味。

2.7高級醇檢測

按照方法1.3.7測定葡萄酒中高級醇產生量，做出各菌株高級醇產生量的比較圖，結果如圖3。

圖3　各酵母菌株高級醇的產生量Fig.3　The production of higher alcohols by yeast strains

葡萄酒中的高級醇主要包括正丙醇、異丁醇和異戊醇3部分，并且異戊醇占70%以上。由圖3可以看出，各菌株的正丙醇和異丁醇產生量相差不大；菌株WY-1和WY-2異戊醇產生量較少，分別為146.61 mg/L和136.17 mg/L；WY-1和WY-2總高級醇產生量也是最少，分別為206.31 mg/L和196.51 mg/L。

3結論

本研究通過對比不同菌株葡萄酒發酵過程中高級醇的產生量以及對乙醇、酸、高糖和SO2的耐受性，生長性能、發酵性能等因素篩選出1株優良葡萄酒酵母菌株WY-1。該菌株高級醇產生量相對較低，并且對乙醇、酸、高糖和SO2都有很好的耐受性，能夠正常生長發酵，有較快的發酵速率和很好的發酵性能，為控制葡萄酒釀造過程中高級醇含量奠定了良好的基礎。

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Screening of wine yeast strains with low yield of higher alcohols

LIU Xue-qiang, QIAN Hong, ZHOU Zheng, ZHANG Cui-ying*

(Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory,College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

ABSTRACTHigher alcohols are important flavor compounds of wine, while fusel alcohols at high concentrations would impart off-flavors. It is an effective measure to reduce the content of higher alcohols by screening low-yield higher alcohols wine yeast strains. In this paper, the production of higher alcohols of six Saccharomyces uvarum strains(WY-1,WY-2,WY-3,WY-4,WY-5 and WY-6)and two wine active dry yeast strains(VL1 and QA23) was analyzed. Duchenne fermentation tube experiment was adopted to compare these yeast strains’ tolerance including alcohol tolerance, sugar tolerance, acid tolerance, and SO2 tolerance. The growth performance and fermentation performance of the strains were compared through wine fermentation. The results indicated that the higher alcohols production of WY-1 strain was 206.31 mg/L, which was relatively low. And WY-1 strain could tolerate 16% alcohol, pH 2.65, 400 g/L glucose and 400 mg/L SO2 very well. Besides, WY-1 strain possessed faster growth rate and better fermentation performance. The content of alcohol produced by WY-1 strain could reach 11.01%, which was higher than that produced by other strains. WY-1 strain was screened out as an excellent wine yeast strain with low yield of higher alcohols.

Key wordswine yeast; higher alcohols; fermentation performance; tolerance

收稿日期：2015-10-10，改回日期：2015-10-28

基金項目：國家自然科學基金項目(31471724)；天津市科委自然基金重點項目(14JCZDJC32900)；天津科技大學自然基金項目(20130110); 天津市科技支撐計劃(15ZCZDNC00110)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603013

第一作者：碩士研究生(張翠英副教授為通訊作者，E-mail:cyzhangcy@tust.edu.cn)。