腦轉移瘤動物模型的制備方法及研究進展

崔白蘋，陳 平，孫安陽

（1.鹽城衛生職業技術學院神經退行性疾病與修復實驗室；2.鹽城市第一人民醫院腫瘤科，江蘇鹽城 224005）

腦轉移瘤動物模型的制備方法及研究進展

崔白蘋1，陳 平2，孫安陽1

（1.鹽城衛生職業技術學院神經退行性疾病與修復實驗室；2.鹽城市第一人民醫院腫瘤科，江蘇鹽城 224005）

腦轉移瘤（brain metastasis）是指源于中樞神經系統以外的腫瘤細胞轉移到腦組織的顱內常見惡性腫瘤。目前腦轉移瘤造模有外周接種和直接腦內接種瘤細胞兩大類方法。外周接種方法包括造模動物左心室或頸動脈內注射、原位接種等途徑；腦內接種方法包括腫瘤細胞株直接接種于動物特定腦區的簡化方法和臨床腦轉移瘤活檢標本直接接種于裸大鼠腦內的新方法。該文綜述了腦轉移瘤模型的制備方法，包括可選用的接種動物、瘤細胞系、接種方法和模型的檢測方法，并介紹這一領域的最新研究進展。

腦轉移；腫瘤；動物模型；裸鼠；細胞接種；制備方法；檢測方法

腦轉移瘤是成年人最常見的顱內惡性腫瘤，外周腫瘤腦轉移的發生率為10％～40％，患者數量大約是原發性腦腫瘤的10倍。未治療的腦轉移瘤患者中位生存期1～2月，治療后延長為4～6月［1］。腦轉移瘤的原發病灶以肺癌最多見，其次是乳腺癌、惡性黑色素瘤、消化道腫瘤和腎癌；以腫瘤發生腦轉移的機率看，以黑色素瘤最易發生腦轉移（50％左右），其次為小細胞性肺癌和乳腺癌。兒童腦轉移瘤的原發腫瘤則以白血病、淋巴瘤多見。臨床腦轉移瘤雖已嘗試多種治療方法如手術切除、全腦放療、立體定向放療和化療，但效果欠佳，尚缺乏有效的治療手段。因此，迫切需要建立理想的腦轉移瘤實驗模型，以加強其分子機制與治療措施的研究。

1 腦轉移瘤的轉移途徑、部位與分子機制

腫瘤細胞向腦內轉移的途徑主要是通過血液，其中最多是通過動脈系統，通過靜脈或淋巴系統轉移并不常見。腦室內轉移見于脊髓腫瘤的上行性侵犯。大多數患者的腦轉移瘤為多發性，瘤細胞侵入附近的毛細血管網，由頸動脈和椎動脈系統到達腦內形成多個大小不一的轉移灶，常位于大腦中動脈分布區，即額葉和頂葉區。腦轉移瘤80％分布于大腦，15％小腦，5％腦干。另外，急性白血病可見軟腦膜和蛛網膜轉移；兒童惡性淋巴瘤等可見硬腦膜轉移。與原發腦瘤不同，腦轉移瘤與周圍組織分界清楚。

腫瘤轉移經歷兩個階段：①局部侵襲（invasion）、滲入血管（intravasation）與散播（dissemination）；②溢出血管（ex-travasation），進入組織，在組織內形成瘤細胞克隆（coloniza-tion）。腦轉移瘤發生、發展是瘤細胞與腦內微環境（如基質）相互作用的結果［2］，即“種子－土壤”學說。以乳腺癌腦轉移為例，腫瘤細胞通過非開窗型毛細血管溢入腦組織，其中環氧合酶COX2、表皮生長因子受體配體HBEGF和α2，6-唾液酸轉移酶ST6GALNAC5是瘤細胞通過血腦屏障的關鍵介導分子［3］。在上述一系列過程中起重要作用的分子尚有：血管內皮生長因子（VEGF）高表達促進腫瘤血管新生；表皮生長因子EGF促進腫瘤生長；基質金屬蛋白酶（MMP-1）［4］、組織蛋白酶cathepsin S［5］促進腫瘤侵襲；黏附分子（E-cad-herin）參與腦轉移瘤形成的多個步驟。DNA雙鏈缺口修補基因BARD1、RAD51抵抗自由基毒性，促進腦轉移瘤克隆形成。

2 腦轉移瘤動物模型的類型

由于黑色素瘤自發性腦轉移在臨床較常見，在腦轉移瘤模型研制初期試圖從嚙齒類動物中尋覓黑色素瘤的自發性模型。發現的第1個小鼠黑色素瘤細胞株B16-F1來自于C57BL/6小鼠耳部，經反復接種、篩選獲得的亞系B16-B10b 與B16-B10-n左心室接種有明顯的腦轉移潛能［6］。通過紫外照射或致癌物暴露可誘發嚙齒類或其他動物惡性腫瘤，再從中篩選出腦轉移瘤細胞株。如瘤細胞與造模動物同系，所制備的模型稱為同源性模型（syngeneic models）。同源性模型的優點為免疫功能保留，可研究瘤細胞宿主反應；缺點是瘤細胞為動物來源，與患者腫瘤細胞存在生物學差異。在80年代以后轉向人－鼠異源性模型（xenograft models），即用人源性腫瘤細胞接種于鼠體內造模。異源性模型又以接種部位與原發腫瘤的異同而分為原位（orthotopic）模型與異位（ectopic）模型。各種異源性與同源性腦轉移瘤模型的優點與局限性總結見Tab 1。

3 腦轉移瘤動物模型的制備方法

3.1 造模常用動物 制備異源性腦轉移瘤模型選用免疫缺陷動物，常用裸鼠［7］和（或）嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）［9］等，一般在4～6周齡造模。制備同源性模型常用正常免疫功能的動物。

3.1.1 裸鼠 裸鼠包括裸小鼠（nu）和裸大鼠（rnu），是位于第11對染色體上的裸基因nu隱性突變所致。裸小鼠純合子胸腺僅有殘跡，沒有T淋巴細胞正常分化，B淋巴細胞和NK細胞基本正常，因而缺乏成熟T淋巴細胞所執行的輔助與殺傷功能，不能產生細胞毒效應與移植排斥［7］。裸小鼠隨月齡增長，T細胞會有所增加，故后述的瘤細胞接種實驗常采用4～6周齡幼鼠。另外，裸小鼠正常的NK細胞功能也會制約瘤細胞的播散。裸大鼠T細胞缺陷的特征與裸小鼠相似，用于腦轉移瘤造模［8］有轉移瘤較大、成像或手術容易、組織與血標本量多的優點，但維持成本較高。

3.1.2 SCID小鼠 SCID小鼠（severe combined immune defi-ciency mice）是由常染色體隱性突變而來的另一種免疫缺陷動物。SCID小鼠外觀有白毛，但胸腺、脾、淋巴結的重量是正常的30％以下，組織學上T細胞和B淋巴細胞嚴重缺乏［9］，對人類腫瘤移植的存活率一般高于裸鼠。SCID小鼠的NK細胞、巨噬細胞和粒細胞功能正常，故仍一定程度地制約瘤細胞的散播。另需注意的是SCID小鼠有“滲漏”現象，大約15％的SCID小鼠血中仍可檢測出有限數量的T細胞和B細胞以及一定水平的免疫球蛋白。SCID小鼠的滲漏現象不遺傳，僅需在選種時對留種小鼠進行免疫球蛋白篩選。

SCID小鼠已發展一些變種，如與非肥胖性糖尿病小鼠NOD雜交獲得NOD/SCID小鼠以及再合并白介素-2受體γ-鏈基因敲除的NOD/SCID/IL-2Rγ－/－（NSG）小鼠，其NK細胞活性明顯降低，有利于瘤細胞的散播，適用于原位模型的制備［15，24，30］。

3.1.3 同源性模型可用免疫正常動物 同源性模型可用裸鼠或者常規動物造模，后者降低了動物可得性難度。同源性模型成模較快（2周左右），但缺陷是腦轉移的特異性不高，腦實質轉移率較低。Zhang等［10］將Lewis肺癌細胞經頸動脈內注射入4月齡C57BL/6NCrj小鼠，注射后12 d腦內即檢測到大量瘤細胞，小鼠存活22 d。Hochman等［11］用近交系BALB/c乳鼠（出生后7 d）腹腔注射小鼠T細胞惡性淋巴瘤Rev-2-T-6細胞系，接種后9～14 d先轉移至蛛網膜下腔、脈絡叢、顱神經，但大腦皮質以及白質受累遲（＞1月）而少（＜30％）。

出于成像或注射方便，國內有研究者采用較大接種動物，如張貴祥等［12］采用新西蘭大白兔頸總動脈注射兔VX2肝癌細胞制備腦轉移瘤模型。該造模方法在注射瘤細胞前5 ～10 min先行注射20％甘露醇5 ml·kg－1以開放血腦屏障，接種瘤細胞數量大（約需106～108個），造模兔存活期短于1個月。該兔模型也有顱外與腦膜成瘤比例偏高、腦實質轉移特異性低等缺點。

3.1.4 轉基因或基因敲除小鼠 通過遺傳技術導入癌基因或失活抑癌基因，可制備腫瘤的遺傳性小鼠模型，但由于原發瘤發展過快而導致轉移瘤的發生機率不高。僅少數通過轉基因或基因敲除途徑制備的小鼠腫瘤模型可發生多器官（包括腦）轉移，例如癌基因Ret轉基因產生的皮膚黑色素瘤；HCCR-2轉基因產生的乳腺癌；肺上皮細胞Trp53與Rb1條件性基因敲除［13］產生的小細胞肺癌。另一方面，將轉基因或基因敲除技術與瘤細胞心內注射方法結合起來［5，14－15］可用以研究特定基因或分子對腫瘤腦轉移的調節作用或提高造模成功率。如前所述，裸鼠或SCID小鼠尚存NK細胞活性，而重組激活基因Rag2－/－與白介素-2受體γ鏈IL-2Rγ－/－雙基因敲除小鼠則缺乏T細胞、B細胞和NK細胞活性，可替代裸鼠或SCID小鼠成功用于Her2陽性的乳腺癌細胞腦轉移瘤造模［14］。總之，基因工程小鼠腫瘤模型或技術代表著腦轉移瘤動物模型研制的一個新方向。

3.2 造模常用的腫瘤細胞系 制作腦轉移瘤模型選用的細胞系因原發瘤不同而異，以乳腺癌和肺癌腦轉移模型研究與應用得最多。

乳腺癌腦轉移模型通常采用三陰性乳腺癌（triple-nega-tive breast cancer）細胞系造模。三陰性乳腺癌細胞不表達雌激素受體（ER）、孕酮受體（PR）和人表皮生長因子受體2 （Her2/neu），對于常規化療不敏感。三陰性乳腺癌初始細胞系MDA-MB-231并無形成腦轉移的特異性。Yoneda等［16］將MDA-MB-231母代細胞系經若干次“外周接種－腦轉移－傳代培養－外周接種”循環篩選后，篩出優先轉移到腦（brain-seeking）的乳腺癌細胞亞系MDA-MB-231BR，在裸小鼠心內注射后僅產生腦轉移。通過病理學或MRI成像顯示，2％的注射細胞在腦內形成較大的轉移灶，5％的注射細胞仍然呈休眠狀態［17］。為了方便成像，231BR細胞又轉染增強綠色熒光蛋白（eGFP）或者螢火蟲熒光素酶，但轉染熒光素酶可改變瘤細胞生物學特性，降低腦轉移的特異性，轉染eGFP則影響較小。因而，MDA-MB-231BR或再表達eGFP的細胞系是目前乳腺癌腦轉移造模最常用的細胞系。其他的人乳腺癌細胞系如MA11、MCF-7等，因造模潛伏期過長或腦轉移特異性不高已很少使用。

肺癌腦轉移動物模型研制相對滯后，目前尚未建立肺癌特異性腦轉移的模型。肺癌細胞系A549細胞為人肺泡基底上皮腺癌細胞，裸鼠心內注射A549細胞并不產生腦轉移，因而需采用腦內直接注射的方法造模［17］。將A549細胞過表達金屬蛋白酶ADAM9增加瘤細胞的侵襲性，注射后可產生腦內微轉移灶［18］。非小細胞肺癌細胞系EBC-1經反復篩選之后獲得高腦轉移的細胞亞系EBC-1/brain，左心室注射后獲得較高幾率的腦轉移［19］。雷貝等［20］從中國人肺腺癌細胞系CPA-Yang1通過體內外篩選獲得較高腦轉移潛能的亞系CPA-Yang1-BR，一次接種可有1/2的裸小鼠產生腦轉移。用于轉移瘤造模的其他非小細胞肺癌細胞系尚有PC-9、PC-14、A925LPE3等［21－22］。另一方面，有研究者采用的小細胞肺癌細胞系NCI-H187、DMS273肺內接種，以制備原位小細胞肺癌腦轉移模型，腦轉移發生幾率（20％左右）與特異性均不高，但從DMS273篩選的G3H亞細胞系腦轉移能力提高［23］。

人或小鼠的黑色素瘤細胞系很多，各實驗室用于制備腦轉移模型的細胞系也各不相同。Rozenberg等［24］比較了原位皮下接種11種黑色素瘤細胞系腦轉移模型潛力的差別，發現其中A375、A2058、RPMI8322、WM2664細胞產生較高比例的腦轉移。將人黑色素瘤多種細胞系用超順磁性的氧化鐵納米顆粒標記后再左心室內接種［25］，可方便成像追蹤。人前列腺癌細胞DU145心內注射后并不能形成轉移瘤，但其Ras突變亞系DU145/RasB1用于造模可形成骨和腦轉移［26］。

3.3 瘤細胞接種方法 腦轉移瘤異位模型的構建通常采取動物左心室內（Fig 1）或頸動脈注射；原位模型目前應用較多的是動物肺內、乳腺脂肪墊或皮下接種。

3.3.1 左心室內注射 左心室內注射是異位模型最常用的接種方法。以小鼠心內盲注射為例：小鼠適當麻醉后仰臥固定，胸部消毒備皮。注射瘤細胞數量大約為1×106，懸浮于100 μL磷酸鹽緩沖液；用0.25～0.5 ml注射器，27～28 G針頭。在胸骨上切跡與劍突的中點偏左標記注射點，從左心室腔正上方可垂直進針；也可將注射點向外下移動少許，以45°角朝左心室進針，以方便使用注射推進裝置。待見到明顯回血后即固定針頭位置，分段間斷推注。注射完畢后以輕微負壓退針。

小鼠心內盲注射法為非直視下操作，有一定的注射失敗幾率，部分小鼠還可能在注射點附近的心壁和肺部形成腫瘤。有條件的實驗室可采用小動物超聲成像（如Vevo 770高分辨率小動物超聲影像系統）輔助小鼠心室內注射［27－28］：動物麻醉后仰臥固定，先調節好超聲影像探頭位置以清晰顯示左心室超聲心動圖像；再將注射器固定于可操縱的推進裝置，在動態超聲影像輔助下將針尖推進至左心室腔內，以準確注射。與盲注射方法相比，使用小動物超聲成像輔助不僅注射準確，造模成功率提高，造模小鼠死亡率也從20％～25％大大降低到1％～2％，因手術引起的體重下降也有所緩解。另外，如果注射的瘤細胞有熒光素酶標記，可用小動物PET成像來檢查心內注射的準確性，正確心內注射的小鼠其熒光素酶信號迅速分布于動物全身。

即使心內注射準確完成，仍然有一部分造模動物在注射瘤細胞后死亡。瘤細胞具有促凝血活性，可引起廣泛的血栓形成與栓塞，可能是導致動物死亡的主因。Stocking等［29］報道在瘤細胞心內接種前10 min尾靜脈注射低分子量肝素（enoxaparin）10 mg·kg－1可大大減少隨后瘤細胞接種引起的造模動物死亡。瘤細胞操作應置于冰上。

Fig 1 Brain metastasis formation following intracardiac injection of tumor cells

3.3.2 頸動脈接種 頸動脈接種也模擬瘤細胞血行腦轉移。頸動脈注射雖在直視下操作，但注射技術要求高，注射瘤細胞數量與體積受限，易發生注射局部腫瘤生長，故較少應用。仍以小鼠頸動脈注射為例：小鼠麻醉后仰臥固定，頸部行正中切口，分離出一側頸總動脈。注射瘤細胞數量通常在5×104上下，懸浮于5或10 μL磷酸鹽緩沖液，用10～20 μL微量注射器，32～33G針頭。于頸總動脈分叉下方5～6 mm處進針，可下墊小金屬柄以方便進針。注射后用明膠海綿輕壓或絲線結扎止血，縫合切口。

3.3.3 原發瘤原位接種 原發瘤原位接種模型（orthotopic models）與臨床腫瘤轉移發生情況最為接近，包括腦轉移瘤發生發展的各個環節。早期研究發現，腫瘤細胞原位接種不同于臨床晚期，難以形成轉移灶。近些年，通過研制高轉移特性的細胞株、基因工程技術改變接種的微環境等手段使原位接種模型研制取得明顯的進展。受解剖特點、臨床相關性等因素影響，腫瘤轉移原位模型研究較多的是肺癌、乳腺癌和黑色素瘤。人小細胞肺癌細胞系NCI-H187、DMS273接種至裸鼠肺部，可以在骨、腎和腦形成轉移［23］。人乳腺癌細胞MDA-MB-231［15，30］、小鼠乳腺癌細胞4T1亞系4TBM［31］也用于乳腺癌細胞腦轉移原位模型的制備，通常將癌細胞接種于裸小鼠乳腺脂肪墊或乳腺導管。黑色素瘤原位接種為皮下注射，因較易操作而被廣泛應用。人黑色素瘤細胞系WM239A的變異株131/4-5B1、131/4-5B2皮下注射后97～180 d檢測到腦實質轉移瘤［32］。裸小鼠皮下接種其他黑色素瘤細胞系YDFR.CB3、A375、A205890等［24］，大于90 d后可見類似的腦實質轉移。原位模型的缺點有成模潛伏期較長，常需要7～12周或以上，一般產生多個器官的轉移。

3.3.4 其它外周接種途徑 尾靜脈注射易于操作，雖曾是小鼠瘤細胞接種的一個途徑，但尾靜脈注射后瘤細胞大部分滯留在肺部，肺部以外的器官如骨、腦發生轉移瘤的概率不高，故現已少用。尾靜脈注射尚因肺癌惡病質，易致小鼠在腦轉移瘤形成之前死亡。另外，靜脈注射造模方法與臨床患者多由動脈血運產生轉移瘤的情況不一致。

腹腔接種更易操作，也被個別研究者采用。Hochman等［11］用BALB/c小鼠腹腔接種鼠惡性淋巴瘤細胞Rev-2-T-6構建腦轉移的同源性模型，發現瘤細胞主要經脈絡叢和顱神經轉移，較少轉移至腦實質，說明腹腔接種造模也具有明顯的局限性。

3.3.5 直接腦內接種 心內注射能模擬臨床腫瘤血行腦轉移的特點，但實驗操作有一定難度，且成模率有限制，一部分研究者采用腫瘤細胞直接接種到特定腦區的簡化方法，以快速成模，尤其適用于一些無明顯腦轉移特性的腫瘤細胞株。當然，這種模型非嚴格意義上的轉移瘤模型，而稱之局部生長模型更為準確。這種造模方法借助于腦立體定位儀，采用裸大鼠等較大免疫缺陷動物，接種部位有尾狀核、丘腦腹后內側核等。人肺腺癌細胞株A549沒有腦轉移特性，Pishko等［33］將A549細胞直接接種于裸大鼠腦尾殼核內，來作為肺癌腦轉移的大鼠模型，用于VEGF單克隆抗體療效的研究。

有一些研究者為了避開應用瘤細胞株，而將臨床腦轉移瘤活檢標本直接種于裸大鼠腦內［34］。這種模型的優點是很大程度上保留了臨床腫瘤的原有特性，并部分保留了腫瘤基質成分，適用于治療方法研究。

4 腦轉移瘤動物模型的檢測方法

4.1 影像學檢測 臨床腦轉移瘤檢查方法有CT、正電子發射成像（PET）和磁共振成像（MRI）等，而動物模型腦轉移瘤很小，影像學檢測方法主要為磁共振成像，且需采用高分辨率儀器與多模式成像（multimodal imaging）等技術。早期3.0T磁共振成像多用于較大動物模型如裸大鼠模型，用于裸小鼠檢測靈敏度不足，后者需要應用7.0T或以上的小動物磁共振成像儀。多模式成像技術包括T2加權成像、釓增強后T1加權成像、動態磁敏感對比增強灌注加權成像，以顯示腫瘤血管分布與血流灌注情況的變化。用氧化鐵納米顆粒磁標記腫瘤細胞造模，可以實現單個瘤細胞磁共振腦成像追蹤和全腦自動定量［25］。腦轉移瘤定期影像檢測可提供多病灶動態發展的資料，而單細胞水平磁共振腦成像對于追蹤休眠期瘤細胞或微轉移灶有重要價值。

常規釓增強MRI僅對較大腫瘤敏感。為提高檢測靈敏度，牛津大學Sibson實驗室發展了分子MRI方法［35］，用連接抗體的氧化鐵微顆粒作為靶向造影劑對血管內皮黏附分子-1（VCAM-1）進行MRI成像。裸小鼠心內注射小鼠4T1瘤細胞和SCID小鼠心內注射人MDA-231-BR細胞制備乳腺癌腦轉移模型，在注射瘤細胞5 d后，VCAM-1靶向分子MRI成像即可檢測到腦內轉移瘤信號，檢測靈敏度較常規MRI方法提高2～3個數量級。選擇血管形成、細胞運動與凋亡、組織炎癥特異分子建立各種靶向磁共振成像方法，可以動態檢測腦轉移瘤微環境的分子與細胞變化。

4.2 病理生物學檢測

4.2.1 常規HE染色 腫瘤組織學檢測最基礎的方法是蘇木精－伊紅（HE）染色，腦轉移瘤動物模型分析要盡量采用系列的全腦完整切片。HE染色可以觀察組織細胞的分化程度和異型性大小。腦轉移瘤模型的瘤細胞形態差異雖較臨床標本小，但瘤細胞核通常染色仍較深、排列密集、易見核分裂。如有必要，HE染色成像后可用1％鹽酸乙醇液脫色，再做免疫組化染色來獲得腫瘤細胞來源等信息。

4.2.2 特殊染色 特殊染色用于顯示組織中的正常結構或病理物質，與腦轉移瘤相關的方法包括改良的Gomori銀氨法和Alcian blue/PAS復合染色。

Gomori銀氨法將網狀纖維染成黑色，可用于癌與肉瘤的鑒別診斷：癌細胞間多無網狀纖維；肉瘤細胞間多有網狀纖維。Gomori銀氨法還可用于腦轉移瘤與原發瘤的鑒別，轉移瘤常有明顯的網狀纖維，而腦內大多數原發瘤網狀纖維很少。Alcian blue染色顯示硫酸粘多糖。腦轉移瘤細胞分泌的粘蛋白以酸性為主，可被Alcian blue深染成藍色，而PAS （Periodic Acid-Schiff）染色法檢測組織中的糖類。腦轉移瘤組織被Alcian blue/PAS復合染色顯示為藍紅色。

4.2.3 免疫組化與免疫印跡 腫瘤組織的分子標志物常用免疫組化方法檢測，例如，Ki-67及增殖細胞核抗原PCNA是廣泛采用的增殖相關標志物，其免疫反應性與腫瘤分級及預后相關。血細胞簇分化抗原CD系列不僅用于區分不同發育階段和不同亞類淋巴細胞，還可用于顯示腫瘤組織血管增殖（如CD31）［36］。一些細胞結構蛋白常用于顯示腫瘤來源，如角蛋白cytokeratin（上皮細胞、間皮細胞、癌細胞）、波形蛋白vimentin（間葉組織、肉瘤細胞）、S-100（神經組織、黑色素瘤）等。臨床常用的腫瘤分子標志物也可選擇性用于對應的腦轉移瘤動物模型檢測。另外，如果腦轉移瘤造模采用表達綠色熒光蛋白的瘤細胞系，可在熒光顯微鏡下直接觀察到腦轉移瘤病灶。

由于腦轉移瘤多發且大小形狀不一，定量檢測相對困難。筆者曾設計了腦轉移瘤半腦或全腦標本采用GFP等標簽蛋白免疫印跡方法，結合全腦片病理學檢查來進行腦轉移瘤的半定量檢測，并介紹給同事應用［37］，取得了良好效果。

5 小結與展望

臨床腦轉移瘤治療困難，預后較差，持續推動了腦轉移瘤動物模型研制成為一個研究熱點。不同類型的腦轉移瘤模型側重反映轉移瘤發生發展的不同環節，以原位模型反映的環節最為全面。動物自發或誘導的同源性模型保留了宿主的免疫功能，可用于研究瘤細胞與宿主微環境之間的相互作用，但由于瘤細胞為動物來源，所得結果必須在患者標本上加以驗證。人－鼠異源性模型是目前方法最成功、應用最多的模型。其中的異位模型雖然因左心室或頸動脈內注射跳過了原發瘤生長、外侵、滲入血管之前的環節，但仍可用于惡性腫瘤經過血道轉移至腦的機制研究。另外，異位模型的成模穩定性好于原位模型，可用于治療措施的研究。原位模型與臨床腫瘤腦轉移最為接近，但成模所需的時間也最長，目前在腦轉移特異性和成模率上尚有缺陷，期待未來不斷完善。腦內直接接種模型省略了腫瘤腦轉移的大部分環節，適用于試驗腫瘤細胞局部生長或治療措施。另外，動物模型將如何模擬與復發有關的腫瘤休眠（tumor dormancy），尚待進一步研究。

目前的腦轉移瘤動物模型在成模方面存在不同動物個體之間的較大差異，使治療措施的試驗仍面臨較大挑戰。借助小動物活體影像學動態檢測與自身前后對照可克服上述限制，尤其是近幾年發展了單個瘤細胞成像示蹤和分子靶向磁共振等靈敏方法。然而，對于大多數無動物磁共振影像檢測條件的實驗室，進一步研制出更穩定、個體差異小的動物模型將有廣泛的實用價值。

利用基因工程技術導入癌基因或失活抑癌基因是腫瘤動物模型研制的一個新方向，可以與傳統造模方法結合起來。CRISPR-Cas9新技術是基因編輯與中止的強有力工具，它通過人工設計具有引導作用的sgRNA（short guide RNA），將核酸酶Cas9引導到基因組的靶點上，對DNA進行定點切割。麻省理工學院的研究人員已經使用CRISPR-Cas9系統構建了高效、快速的基因敲除動物模型制備新方法。最近他們又報道了另一個新方法，將CRISPR-Cas9系統用于高效體內篩選全基因組與腫瘤生長和轉移相關的抑癌基因［38］。研究人員先將基因組規模的sgRNAs文庫導入無轉移特性的小鼠瘤細胞系，再將基因突變的細胞系注射進免疫缺陷動物，以快速產生轉移瘤；通過在轉移瘤中富集的sgRNAs找到其靶點，即與腫瘤轉移有關的抑癌基因。相信通過類似的技術不久便可找到導致腫瘤腦轉移的關鍵基因，在此基礎上制備出表型更穩定、機制更明確或與臨床情況更相似的腦轉移瘤動物模型。

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Animal models of brain metastasis：preparation methods and research progress

CUI Bai-ping1，CHEN Ping2，SUN An-yang1
（1.Laboratory of Neurodegenerative Diseases and Repair，Yancheng Institute of Health Sciences；2.Dept of Oncology，Yancheng First People′s Hospital，Yancheng Jiangsu 224005，China）

Brain metastasis（BM）is a common brain tumor in a-dults，originating from extracranial location in the body.There has been a growing interest in producing suitable animal models for studying BM in vivo.Current BM models take peripheral or brain route for tumor cell inoculation，including intra-cardiac or intra-carotid artery injection or orthotopic injection.Direct im-plantation of patient tumor biopsies into rodent brain bears ad-vantages of clinical relevance.This review presents a compre- hensive introduction to key elements for establishing animal mod-els of BM，with highlights on selections of suitable model ani-mals，brain-seeking tumor cell lines，reasonable inoculation routes，as well as succedent phenotyping methods.In the end，perspectives and future directions in this field are discussed.

brain metastasis；tumor；animal models；nude mice；cell inoculation；model preparation；model evaluation

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.004.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.002

A

1001－1978（2016）03－0304－06

R-05；R363-332；R739.41；R73-37

2015－10－30，

2015－12－20

崔白蘋（1987－），女，碩士，講師，研究方向：神經系統疾病，E-mail：cuibaiping＠126.com；陳 平（1963－），女，主任醫師，教授，研究方向：腫瘤轉移與治療，共同第一作者，E-mail：doc＿pchen＠126.com；孫安陽（1966－），男，博士，教授，研究方向：神經系統疾病，通訊作者，E-mail：asun08＠fudan.edu.cn