機械吹打法、胰酶消化法分離新生大鼠腦組織神經(jīng)干細胞效果觀察

周權(quán)明，楊小朋，錢章林，徐廣建，王繼超， 陳剛

(1石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院；3蘇州大學附屬第二醫(yī)院)

機械吹打法、胰酶消化法分離新生大鼠腦組織神經(jīng)干細胞效果觀察

周權(quán)明1，楊小朋2，錢章林2，徐廣建2，王繼超2， 陳剛3

(1石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院；3蘇州大學附屬第二醫(yī)院)

目的 對比觀察機械吹打法、胰酶消化法分離培養(yǎng)新生大鼠腦組織神經(jīng)干細胞(NSCs)的效果。方法 取出生3天的新生SD大鼠大腦皮質(zhì)，分別用機械吹打法、胰酶消化法分離培養(yǎng)(分別記為機械吹打組和胰酶消化組)，通過免疫熒光法對NSCs進行鑒定和誘導(dǎo)分化；分別于培養(yǎng)第2、5、7天計數(shù)細胞球直徑及數(shù)目；通過MTT法檢測兩組原代及第3亞代細胞的克隆增殖能力；選取第3亞代細胞進行凍存、復(fù)蘇，計算細胞復(fù)蘇后的存活率。結(jié)果 兩組均可從新生SD大鼠大腦皮質(zhì)分離得到NSCs，并均可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。培養(yǎng)5、7天時，機械吹打組獲得的細胞球數(shù)量和直徑均高于相同培養(yǎng)時間的胰酶消化組(P均<0.05)。機械吹打組原代細胞培養(yǎng)2、5、7天細胞克隆增殖能力均高于相同培養(yǎng)時間的胰酶消化組(P均<0.05)，第3亞代細胞培養(yǎng)2、5 天細胞克隆增殖能力均優(yōu)于相同培養(yǎng)時間的胰酶消化組(P均<0.05)。兩組第3亞代細胞凍存、復(fù)蘇后存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 機械吹打法、胰酶消化法均可成功分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化新生大鼠NSCs，機械吹打法分離培養(yǎng)的NSCs克隆增殖能力高于胰酶消化法。

神經(jīng)干細胞分離；機械吹打法；胰酶消化法；大腦皮質(zhì)；大鼠

神經(jīng)干細胞(NSCs)具有多向分化潛能和自我更新能力，能夠分化為多種神經(jīng)細胞[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、缺血及退行性病變的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前NSCs的培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇技術(shù)尚不完善。2014年12月～2015年10月，本研究采用機械吹打法和胰酶消化法從新生鼠腦實質(zhì)中分離培養(yǎng)原代NSCs，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：出生3天的清潔級SD大鼠25只，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK(新)-2011-0004。主要試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)，美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗，Hyclone公司；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)，英國PeproTech公司；抗巢蛋白抗體(Nestin)、神經(jīng)絲蛋白200抗體(NF-200)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)、FITC、TRITC標記羊抗兔IgG、MTT試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 NSCs體外培養(yǎng)及形態(tài)學觀察 取新生大鼠大腦皮質(zhì)，解剖顯微鏡下用顯微手術(shù)鑷去除軟腦膜和血管組織。用眼科剪將腦組織剪成約1 mm3的小塊并隨機分為機械吹打組及胰酶消化組。機械吹打組采用巴氏吸管輕微吹打，吹打后形成由大量單細胞和少量小細胞球組成的細胞懸液；胰酶消化組采用0.125%胰蛋白酶(含0.01% EDTA)消化組織10 min，以FBS終止消化，得到細胞懸液。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾細胞懸液，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清。臺盼藍染色法計數(shù)活細胞，以1×106/mL密度分別接種細胞于25 mL培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分均為DMEM/F12(1∶1)、2% B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF。每2天半量換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，隨機選取10個高倍視野，記數(shù)神經(jīng)球的個數(shù)、直徑及細胞分化情況。

1.3 NSCs鑒定及誘導(dǎo)分化 將兩組原代細胞分別培養(yǎng)7天，收集形成的細胞球，按照1×106/mL密度進行傳代培養(yǎng)。取傳3代后形成的神經(jīng)球，一部分接種于多聚賴氨酸包被的24孔板，于DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，行Nestin多克隆抗體免疫熒光染色；另一部分接種于含10% FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，行NF-200、GFAP多克隆抗體免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 NSCs的克隆增殖能力觀察 分別取上述兩種方法獲得的原代NSCs、傳代后的第3亞代NSCs懸液，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，各吸取100 μL懸液至96孔板，分別于培養(yǎng)第2、5、7天計數(shù)接種原代NSCs的培養(yǎng)孔中細胞球數(shù)量及直徑；通過MTT法檢測兩組原代及第3亞代NSCs的克隆增殖能力，方法參照試劑盒說明書，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm波長處各孔吸光光度值(OD值)。

1.5 NSCs凍存、復(fù)蘇及存活率檢測 選取兩組第3亞代細胞進行凍存、復(fù)蘇。凍存液由70% DMEM、20% BSA、10% DMSO組成。具體方法：取凍存后復(fù)蘇的細胞懸液，臺盼藍染色，在計數(shù)板上計數(shù)四角大格內(nèi)的細胞總數(shù)，計算細胞復(fù)蘇后的存活率。存活率=存活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 NSCs形態(tài)學觀察 培養(yǎng)2天時，倒置顯微鏡下可見機械吹打組出現(xiàn)懸浮的小細胞團，胰酶消化組基本處于單細胞狀態(tài)。培養(yǎng)3～5天時，機械吹打組細胞團內(nèi)細胞增多，形成由幾十個到上百個圓球形細胞構(gòu)成的細胞球，懸浮生長；胰酶消化組也可見細胞球，但數(shù)量和大小不及機械吹打組。培養(yǎng)6～7天時，機械吹打組可見含數(shù)十至數(shù)百個細胞的集落懸浮于培養(yǎng)基中，形態(tài)較之前更規(guī)則，有部分細胞球死亡，失去周圍光暈，中央?yún)^(qū)暗淡；胰酶消化組上述改變?nèi)跤跈C械吹打組。

2.2 NSCs的鑒定和誘導(dǎo)分化 兩組第3代細胞免疫熒光染色均可見紅色熒光，即Nestin染色均陽性及NF-200、GFAP免疫熒光染色均呈陽性。

2.3 NSCs的克隆增殖能力 見表1、2。

2.4 第3亞代細胞凍存、復(fù)蘇及存活率 兩組凍存的第3亞代NSCs凍存前與凍存復(fù)蘇后細胞形態(tài)、生長速度及其他生物學特性無明顯差別， 細胞均懸浮生長，培養(yǎng)2～4天均形成干細胞球，Nestin免疫熒光染色均呈陽性。機械吹打組和胰酶消化組細胞復(fù)蘇后存活率分別為85%、89%，兩組比較P>0.05。

表1 兩組原代NSCs不同培養(yǎng)時間細胞球直徑和數(shù)量比較±s)

注：與胰酶消化組同時間點比較，*P<0.05。

表2 兩組原代及第3亞代NSCs不同培養(yǎng)時間克隆增殖能力比較(OD值，±s)

注：與胰酶消化組同時間點比較，*P<0.05。

3 討論

NSCs具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，有望用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。但是，由于控制NSCs增殖和分化的因素還不明確[2，3]，尤其是NSCs移植到受損中樞神經(jīng)區(qū)域如何向特定神經(jīng)細胞分化的機制還未取得突破性進展[4]。因此，探索NSCs分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化的技術(shù)意義重大。

機械吹打法和胰酶消化法是分離培養(yǎng)NSCs的常用技術(shù)[5]，但不同實驗室建立的培養(yǎng)體系不同，獲得的NSCs增殖、分化能力等也不同[6]。胰酶消化法可以增加單細胞數(shù)量，但胰酶消化作用的最佳時間點難以把握，分離消化過程中多次離心可導(dǎo)致原代NSCs損傷[7]，且在終止胰酶消化過程中加入的FBS易誘導(dǎo)原代NSCs分化。機械吹打法僅通過機械吹打獲得NSCs，避免了FBS對原代NSCs的影響。本研究兩種方法均可獲得NSCs，并可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。但是在原代培養(yǎng)第5天及第7天，機械吹打法較胰酶消化法獲得細胞球數(shù)量多、細胞球直徑大；原代細胞培養(yǎng)第2、5、7天機械吹打法獲得細胞克隆增殖能力明顯高于胰酶消化組，第3亞代細胞在培養(yǎng)第2、5天機械吹打組細胞克隆增殖能力優(yōu)于胰酶消化組。原因可能為機械吹打法獲得的細胞懸液中存在大量小細胞團，可形成相對良好的微環(huán)境，NSCs通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子可在該環(huán)境局部達到相對高濃度，促進NSCs的生長增殖；而胰蛋白酶消化破壞了影響細胞存活的細胞基質(zhì)、胞膜上的受體等，造成細胞化學損傷，反復(fù)的離心也增加細胞損傷的機會，形成的亞代克隆球的量較機械吹打法明顯減少[8～11]。

NSCs的體外培養(yǎng)過程復(fù)雜，必須注重NSCs的體外凍存與復(fù)蘇等環(huán)節(jié)[12]。本研究取第3亞代NSCs進行凍存復(fù)蘇，結(jié)果顯示兩組凍存前與凍存復(fù)蘇后細胞形態(tài)、生長速度及其他生物學特性無明顯差別，細胞均懸浮生長，培養(yǎng)2～4天均形成干細胞球，Nestin免疫熒光染色均呈陽性，凍存復(fù)蘇后細胞存活率分別為85%、89%，兩組無明顯差別，提示兩種方法獲得的NSCs體外凍存、復(fù)蘇穩(wěn)定。

總之，機械吹打法、胰酶消化法均可從新生鼠腦組織中成功分離培養(yǎng)NSCs，但機械吹打法分離培養(yǎng)的NSCs克隆增殖能力優(yōu)于胰酶消化法。

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Effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells from brain tissues of neonatal rats

ZHOUQuanming1,YANGXiaopeng,QIANZhanglin,XUGuangjian,WANGJichao,CHENGang

(1MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To compare the effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells (NSCs) from brain tissues of neonatal rats. Methods The cerebral cortex of newborn rats within 3 days were isolated and cultured by mechanical and pancreatin digestion, respectively. The NSCs were identified and differentiated by immunofluorescence assay. Diameter and number of cell spheres were detected on day 2, 5 and 7 of culture. The proliferation ability of the primary passage of NSCs and the third-passage NSCs in the two groups were compared by MTT. The third-passage NSCs were frozen and recovered and the survival rate of the cells was calculated. Results Both of these two methods could isolate NSCs from the cerebral cortex of neonatal rats, and those NSCs could be induced to differentiate into neurons and glial cells. On day 5 and 7, the NSCs′ ball number and diameter which came from the mechanical isolation group were higher than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2, 5 and 7, the prime NSCs which came from the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2 and 5, the third-passage NSCs of the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). The survival rates of the third-passage NSCs of the mechanical isolation group and pancreatin digestant group were respectively 85% and 89%, respectively; and there was no significant difference between these two groups (P>0.05). Conclusion Both mechanical isolation and pancreatin digestant isolation can successfully isolate NSCs. NSCs which come from the mechanical isolation group have better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group.

neural stem cells; mechanical isolation; pancreatin digestion; cerebral cortex; rats

國家自然科學基金資助項目(8116055)。

周權(quán)明(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向為中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷。E-mail： 909073436@qq.com

楊小朋(1962-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。E-mail： 307240766@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.006

R338

A

1002-266X(2016)20-0018-03

2015-11-13)