EGCG對帕金森病大鼠行為、學習記憶能力的影響及機制

王楠，梁戰華，齊中華

(大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧大連116600)

EGCG對帕金森病大鼠行為、學習記憶能力的影響及機制

王楠，梁戰華，齊中華

(大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧大連116600)

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對帕金森病(PD)大鼠行為及學習記憶能力的影響，探討其可能的作用機制。方法 將50只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、左旋多巴組及EGCG低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組建立PD模型。模型建立成功后，左旋多巴組給予100 mg/kg左旋多巴灌胃，EGCG低、高劑量組分別給予EGCG 2、6 mg/kg灌胃，對照組及模型組均給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續給藥4周。末次灌胃后，各組均于后頸部皮下注射鹽酸阿撲嗎啡(0.25 mg/kg)，記錄大鼠向右側旋轉的圈數；采用Morris水迷宮檢測潛伏期；采用Western blotting法檢測紋狀體單胺氧化酶B(MAO-B)和TNF-α表達。結果 與對照組比較，其余各組旋轉圈數均增加(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG低及高劑量組旋轉圈數均減少(P均<0.05)。與對照組比較，其余各組潛伏期均延長(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短(P均<0.05)。與對照組比較，模型組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均增高(P均<0.05)；EGCG高、低劑量組紋狀體MAO-B、TNF-α表達較模型組降低(P均<0.05)。結論 EGCG可改善PD大鼠行為及學習記憶能力，其機制可能與下調紋狀體MAO-B和TNF-α表達有關。

帕金森病；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；單胺氧化酶B；腫瘤壞死因子α

帕金森病(PD)是一種以黑質-紋狀體通路多巴胺能神經元退行性病變為主要特征的第二大神經退行性疾病，以肌肉僵直、靜止震顫、運動遲緩和姿勢反射受損為主要臨床表現，且常伴有認知功能障礙[1,2]；氧化應激在PD多巴胺能神經元變性過程中發揮重要作用。迄今為止，PD的治療均為對癥處理，無法阻止疾病進展。近年研究表明，表沒食子兒

茶素沒食子酸酯(EGCG)具有抗氧化和減少活性氧自由基的作用，低濃度即能發揮對凋亡神經元的保護作用[3,4]，但其對PD的作用未見報道。2015年3～ 8月，本研究觀察了EGCG對PD大鼠行為及學習記憶能力的影響，現分析結果，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，體質量250～300 g，購自上海斯萊克公司。6-羥基多巴胺(6-OHDA)、EGCG、左旋多巴、鹽酸阿撲嗎啡(APO)，美國Sigma公司。BCA試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。兔抗單胺氧化酶B(MAO-B)抗體、小鼠單克隆抗TNF-α抗體，Abcam公司。腦立體定位儀(51600型)，美國Stoelting公司。Morris水迷宮，北京碩林苑生物科技有限公司。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為對照組、模型組、左旋多巴組及EGCG低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組參照文獻[5]方法采用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉建立PD大鼠模型。大鼠固定于腦立體定位儀；依照Paxinos & Watson圖譜確定左側紋狀體坐標點，即前后囟后0.8 mm、中線左側3.0 mm、硬膜下5.0 mm；磨鉆于顱骨上述坐標點打孔，以0.5 μL/min的速度向紋狀體部位緩慢注射20 μg 6-OHDA(溶于3 μL含0.2%維生素C的生理鹽水中)，留針5 min后緩慢退針；縫合頭皮。假手術組只定位打孔，不注射6-OHDA，余操作同其他組。術后2周于后頸部皮下注射APO(0.25 mg/kg)以誘導大鼠對側旋轉行為，大鼠旋轉頻率均達到210圈/30 min，提示PD模型建立成功。模型建立后，左旋多巴組灌胃給予100 mg/kg左旋多巴、EGCG低劑量及高劑量組分別灌胃給予EGCG 2、6 mg/kg，對照組及模型組均灌胃給予蒸餾水，均1次/d，給藥體積均為1 mL/只，均連續給藥4周。

1.3 相關指標觀察 ①對側旋轉情況：給藥結束后，各組均于后頸部皮下注射APO(0.25 mg/kg)。將大鼠置于一半球形容器中，穩定10 min，記錄其向右側旋轉的圈數，每個360°旋轉計為1圈，共記錄30 min。②定位航行情況：對側旋轉試驗結束后各組大鼠均放于Morris水迷宮中檢測逃避潛伏期[6]，訓練期為2天，2次/d；于第3天開始記錄潛伏期，3次/d，連續記錄3天(第3、4、5天)。③紋狀體MAO-B、TNF-α表達：采用Western blotting法。完成各項行為學測試后，各組以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭，取出新鮮腦組織置于冰上，根據大鼠腦立體定位圖譜，快速取視交叉前部腦組織(紋狀體)，置于1 mL預冷的裂解緩沖液中，制成勻漿。于4 ℃、12 000 g/min離心10 min，取上清，BCA法進行蛋白定量，置-80 ℃冰箱保存備用。取等量蛋白樣品(30 μg)加上樣緩沖液混合，于95 ℃金屬浴變性10 min，以SDS-PAGE電泳分離，將目的蛋白轉移至PVDF膜；PVDF膜封閉處理，分別加入MAO-B抗體(1∶2 000)及TNF-α抗體(1∶500)，室溫孵育1.5 h，4 ℃孵育過夜；次日加入二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL發光。同一樣本重復檢測3次，以條帶灰度值進行統計學分析。

2 結果

2.1 對側旋轉及定位航行情況 與對照組比較，其余各組旋轉圈數均增加(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG低及高劑量組旋轉圈數均減少(P均<0.05)。各組第3、4、5天潛伏期均逐漸縮短；與對照組比較，其余各組潛伏期均延長(P均<0.05)；與模型組比較，左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短(P均<0.05)；EGCG低劑量組第3天潛伏期比左旋多巴組延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組旋轉圈數及潛伏期比較±s)

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與左旋多巴組比較，△P<0.05。

2.2 紋狀體MAO-B、TNF-α表達 與對照組比較，模型組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均升高(P均<0.05)；EGCG低及高劑量組紋狀體MAO-B、TNF-α表達均較模型組降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組紋狀體MAO-B、TNF-α表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

茶葉中含有大量茶多酚物質，主要成分是兒茶素類化合物，并以EGCG含量最高，具有抗氧化、抗衰老、神經保護、抗腫瘤等作用[7～9]。Guo等[10]研究表明，茶多酚可以通過抗氧化作用保護腦神經，抑制PD發生。Ng等[11]對PD果蠅模型的研究顯示，EGCG可能具有治療PD的作用，并確認了其作用靶點。但國內鮮見EGCG抗PD的相關研究。本研究結果顯示，與模型組比較，左旋多巴組及EGCG低、高劑量組旋轉圈數均減少。各組第3、4、5天潛伏期均逐漸縮短；左旋多巴組、EGCG高劑量組潛伏期均縮短；EGCG低劑量組第3天潛伏期長于左旋多巴組；EGCG低劑量組與高劑量組旋轉圈數及潛伏期比較無明顯統計學差異。證實EGCG可改善PD大鼠的行為障礙及增強其學習記憶能力，其作用效果與經典抗PD藥左旋多巴相似，即具有明確的抗PD功效，低劑量和高劑量的作用效果均較好。

研究證實，氧化應激在PD病變過程中發揮重要作用。Guo等[10]研究發現，茶多酚可降低細胞內活性氧、抑制6-OHDA誘導的NO、神經元型一氧化氮合酶及誘導型一氧化氮合酶高表達，進而改善神經細胞的高氧化應激狀態，發揮神經保護作用。MAO-B是多巴胺分解代謝的關鍵酶之一。在PD的發病過程中MAO-B活性明顯增高，其在氧化分解多巴胺的同時產生一些自由基，引起氧化應激，最終使神經元死亡。抑制MAO-B活性可提高腦內多巴胺濃度，同時可延緩神經元的變性過程，發揮神經保護作用[12,13]。研究發現，PD患者及PD動物模型血清TNF-α水平升高，并具有損傷神經元的作用[14～19]。本研究結果顯示，模型組紋狀體MAO-B和TNF-α表達明顯高于對照組，而EGCG低劑量及高劑量組明顯低于模型組、其中MAO-B甚至低于對照組；提示EGCG抗PD的作用可能是下調MAO-B和TNF-α，并以下調MAO-B為主。

綜上所述，EGCG可改善PD大鼠模型行為障礙及學習記憶能力下降，下調紋狀體MAO-B和TNF-α表達可能是其作用機制之一。

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遼寧省省直醫院改革重點臨床科室診療能力建設項目(LNCCC-C06-2015)。

齊中華(E-mail: qzhdl770716@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.009

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2016-01-07)