環介導等溫擴增技術快速檢測肉中金黃色葡萄球菌

趙玥明，滿朝新，曲艷艷，姜　霞，姜毓君，(東北農業大學食品學院/乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱　50030;東北農業大學國家乳業工程技術研究中心，哈爾濱　50086)

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環介導等溫擴增技術快速檢測肉中金黃色葡萄球菌

趙玥明1，滿朝新2，曲艷艷1，姜霞1，姜毓君1，2
(1東北農業大學食品學院/乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030;2東北農業大學國家乳業工程技術研究中心，哈爾濱150086)

摘要:應用環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術建立了對肉中金黃色葡萄球菌檢測的方法。實驗中，使用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP擴增反應，并針對金黃色葡萄球菌所特有的保守性耐熱核酸酶基因(nuc)設計得到了一套LAMP擴增引物。對LAMP法和PCR法的檢測靈敏度進行了比較，同時對人工污染肉中的金黃色葡萄球菌進行檢測。結果表明:所建立的LAMP法能夠特異性的檢測金黃色葡萄球菌，并且檢測金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度為2.01×100CFU/mL，是普通PCR檢測靈敏度的100倍。在檢測肉中金黃色葡萄球菌時，檢測限為2.01×101CFU/mL。因此，本實驗所建立的LAMP法檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法，具有靈敏、快速以及簡便等的優點，是一種具有很好的發展前景的檢測手段。

關鍵詞:環介導等溫擴增;金黃色葡萄球菌;肉

常見的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生性李斯特菌等，其中金黃色葡萄球菌是一類在人類和動物中常見的病原體［1］，可以引起皮膚和軟組織感染、敗血癥、骨髓炎和肺炎等疾?。?，3］。該菌種通過傳染及毒素介導而導致食物中毒［2］。有文獻已經報道了金黃色葡萄球菌在肉、牛奶以及奶酪等食品中導致了食源性疾病的暴發［4-6］，因而檢測肉中的金黃色葡萄球菌方法的建立有著很重要的作用。

進入21世紀以來，分子生物學技術已經應用在各個檢測領域［7］。目前針對食源性致病菌的快速檢測方法，主要集中在PCR技術、基因芯片技術、ELISA法、生物傳感器技術等，但都存在著一定程度上的不足［8］。例如，PCR技術已經被應用于檢測多種致病菌，但是PCR技術需要昂貴的熱循環儀器，經驗豐富的實驗人員并且需要擴增幾個小時［9］。為了克服PCR技術的不足，環介導等溫擴增(LAMP)技術是近幾年發展起來的一門新技術，在60～65℃之間進行恒溫擴增［10］。該擴增反應通過自主序列復制和鏈置換的擴增方式，使得擴增產物形成類似花椰菜結構，電泳時呈現出階梯式圖譜，在1h內完成反應，因此縮減了檢測時間，并且LAMP反應可在水浴鍋中進行，極大的降低實驗成本［11］。因此，該方法具有準確、快速、簡便等的特點。

本實驗應用最新研發出來的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進行LAMP反應體系的構建，使得較之前的大片段DNA聚合酶所構建的LAMP反應［9，12，13］，該酶在2012年首次得以應用［14］。根據實驗結果可知，該酶具有許多優點，例如，可以提高反應速率，提高持續的合成能力，較普通的Bst大片段DNA聚合酶具有更好的熱穩定性［14-16］。本實驗所建立的環介導等溫擴增技術檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法，達到了更為穩定、快速、特異、靈敏的檢測目的，具有更好的應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用菌株見表1。

Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，New England Biolabs;細菌基因組DNA提取試劑盒以及Taq PCR Master-Mix，北京天根生物技術有限公司;甜菜堿(Betaine)，美國Sigma公司; dNTP，北京天根生物技術有限公司; DNA marker，北京百泰克生物技術有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest公司; Tc-25/H型基因擴增儀，美國PCR Kin Elmer Gene Amp; DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠; UVP凝膠成像儀，美國UVP公司。

1.2實驗方法

1.2.1不同菌種的培養以及DNA模板的提取取金黃色葡萄球菌ATCC13565作為標準菌株，3株金黃色葡萄球菌(ATCC25923、CMCC26074、CMCC26075)作為參考菌株以及其他25株非金黃色葡萄球菌菌株進行特異性實驗。金黃色葡萄球菌及其他菌種，分別活化培養于NB以及復合增菌培養基BPW中，37℃培養過夜。分別吸取對數生長期的菌懸液1mL，采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，將所得到的DNA模板于－20℃保存備用。

表1　實驗所用菌株及來源

1.2.2 LAMP引物的設計與合成在GenBank中尋找到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)，該基因具有特異性好的特點，并且具有高度的保守性。因此，本文應用此特異性基因nuc序列進行引物的設計［50，81］。采用在線的Primer Explorer4.0引物設計軟件，針對特異性的目的片段設計得到了一套特異性引物，如表2所示。

1.2.3 LAMP反應體系的建立及反應條件的優化

LAMP反應體系(25μL)包括:內引物FIP和BIP、外引物F3和B3、MgCl2、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、DNA模板、10×Buffer、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，滅菌水補足體系。將混合物在65℃恒溫60min進行擴增，之后將體系加熱到80℃持續5min以終止反應。選擇對LAMP體系中的關鍵因素進行優化，包括鎂離子濃度(2、4、6、8、10mmol/L)、dNTP濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2mmol/L)、外引物與內引物濃度比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、甜菜堿濃度(0、0.4、0.8、1.2、1.6mol/L)、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μL)，根據LAMP擴增后電泳圖條帶的有無和亮度選擇最適條件，建立LAMP反應體系。

表2　金黃色葡萄球菌nuc基因LAMP引物序列

建立LAMP反應體系后，將反應體系分別在61℃、62℃、63℃、64℃及65℃條件下進行擴增反應，確定最適反應溫度。并在確認的最適反應溫度下，進行LAMP反應，分別擴增15、30、45、60、75min，擴增后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，確定LAMP反應的最適反應條件。

1.2.4 LAMP檢測金黃色葡萄球菌的特異性按照1.2.1的方法，提取4株金黃色葡萄球菌以及其他26株非金黃色葡萄球菌的DNA，分別作為LAMP反應的模板，進行擴增反應，取擴增后的產物5μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察實驗結果。

1.2.5 LAMP及PCR方法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的比較應用平板計數法得到初始菌液濃度為2.01× 109CFU/mL。取1mL處于對數生長期的金黃色葡萄球菌純培養液，用0.85%生理鹽水進行10倍梯度稀釋。用試劑盒對不同濃度的金黃色葡萄球菌菌液提取基因組DNA，并作為模板分別進行PCR和LAMP反應。分別取5μL反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得實驗結果。

建立PCR法檢測金黃色葡萄球菌的反應體系為25μL: 12.5μL of Taq PCR MasterMix，1μL F3以及1μL B3，2μL模板DNA，用蒸餾水補足體系至25μL。反應條件: 94℃預變性5min，94℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環，72℃延伸5min。取5μL PCR反應產物，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察擴增效果。

1.2.6 LAMP檢測人工污染肉中金黃色葡萄球菌購買鮮肉25g，經國標法確認肉中不含金黃色葡萄球菌。按照國標法GB 4789.10—2010，將所購買的25g鮮肉放入含有225mL BPW的無菌均質袋中，混勻后每25mL為1組，分裝10組，分別添加109～100CFU/mL不同濃度的金黃色葡萄球菌2.5mL，制成金黃色葡萄球菌濃度為108～10－1CFU/mL的人工污染肉漿，應用試劑盒提取每組中的金黃色葡萄球菌DNA作為模板，分別進行LAMP反應。

2　結果與分析

2.1 LAMP反應體系的建立及反應條件的優化

通過優化LAMP反應體系，確立了最終LAMP反應體系為: 0.4mmol/L的F3及B3，2.4mmol/L的FIP和BIP，4mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，0.4mol/L甜菜堿，0.9μL的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8U)，2.5μL 10×Buffer及2μL模板。最佳反應條件為:在64℃條件下，對金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC13 565采用優化的LAMP體系擴增60min。擴增后電泳結果如圖1，陽性組呈現出LAMP產物所特有的梯狀條帶，而以滅菌水為模板的空白組，則未出現梯狀條帶。

圖1　金黃色葡萄球菌LAMP檢測結果

2.2 LAMP檢測金黃色葡萄球菌的特異性

4株金黃色葡萄球菌為模板的泳道均有LAMP特異性的條帶產生，而其他26株非金黃色葡萄球菌均呈陰性，無特異性的梯形條帶。結果如圖2所示。

2.3 LAMP及PCR法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的比較

原始金黃色葡萄球菌菌液濃度為2.01×109CFU/mL，從圖3可知，2.01×109～2.01×100CFU/mL都有典型的LAMP擴增產物的梯形條帶，而2.01×10－1CFU/mL未見LAMP擴增。由此可見，LAMP方法檢測金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為2.01×100CFU/mL。對比圖4可知，PCR法檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度是2.01× 102CFU/mL。通過比較可知，本實驗所建立的LAMP法檢測金黃色葡萄球菌的檢出限是PCR法的100倍。

圖2　 LAMP檢測金黃色葡萄球菌靈敏度電泳圖

圖3　 PCR檢測金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度電泳圖

2.4 LAMP檢測人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的靈敏度

如1.2.6中所示，人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的濃度為2.01×108～2.01×10－1CFU/mL，分別進行LAMP擴增反應，LAMP法檢測人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的檢出限為2.01×101CFU/mL (圖4)。

圖4　 LAMP檢測人工污染肉中金黃色葡萄球菌的靈敏度電泳圖

3　討論

目前，基于核酸擴增檢測食源性致病菌的方法已得到了飛速的發展。針對于金黃色葡萄球菌的檢測方法，主要圍繞著傳統的分離培養和生化鑒定相結合的方法、PCR法以及熒光定量PCR法［17-19］。近幾年已有應用Bst大片段DNA聚合酶進行LAMP擴增檢測金黃色葡萄球菌，但都未從肉基質中進行檢測［19］。而本文應用了Biolab公司最新研發出的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進行LAMP擴增。該酶較傳統的Bst大片段DNA聚合酶的優點在于，該酶是熱啟動酶，無需低溫條件下配制反應體系，即可保證酶催化反應的特異性，從而使反應更適合于現場的食源性致病菌檢測，為該方法的實際應用創造了更大的可能。經比較得知傳統的分離培養檢測方法需要5d左右，PCR及熒光定量PCR法需要3～4h，LAMP方法只需1h即可擴增109倍從而達到檢測目的［10］。同時，也有報道稱LAMP反應不易受食品基質中成分的抑制作用，對DNA模板純度要求不高［20］。因此可知，LAMP檢測方法具有快速、特異、靈敏等的優點。然而，正因為LAMP方法的高靈敏性，導致了該方法易產生假陽性的污染問題。因此，要特別注意實驗的分區操作，從而防止假陽性的產生。此外，LAMP檢測方法所具有的高特異性，是由于該方法識別了目的片段的6個區域，需要設計4條特異性引物，因而導致了反應復雜因素增多。

本研究應用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶建立了LAMP技術檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法。由于該方法具有靈敏、快速以及簡便的優點，使得該方法為基層檢測提供了一個新的思路，具有很好的發展前景，在食品安全檢測領域有望得到廣泛的應用。

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(責任編輯李燕妮)

Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Raw
Meat Samples by Loop-mediated Isothermal Amplification

ZHAO Yue-ming1，MAN Chao-xin2，QU Yan-yan1，JIANG Xia1，JIANG Yu-jun1，2
(1Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

Abstract:We established a method to detect Staphylococcus aureus in meat by loop-mediated isothermal amplification.During the experiment，using the latest Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase to finish the LAMP amplification reaction，and against S.aureus-specific nuclease resistant conserved gene (nuc) designed LAMP amplification primers.the detection sensitivity of LAMP and the PCR method were compured，while was detect Staphylococcus aureus.the artificially contaminated meat The results showed that the built LAMP method could specifically detect Staphylococcus aureus，and Staphylococcus aureus bacteria in pure sensitivity 2.01×100CFU / mL，which was 100 times the normal PCR detection sensitivity.the detection limit of detecting Staphylococcus aureus in meat was 2.01×101CFU / mL.Thus，the LAMP method to detect Staphylococcus aureus in meat was established，which had the advantage of sensitive，rapid and simple，which was a kind of good prospects for development of testing methods．

Keywords:loop-mediated isothermal amplification; Salmonella aureas; meat

通訊作者:姜毓君(1971—)，男，博士，教授，研究方向:食品科學。

作者簡介:趙玥明(1990—)，女，在讀博士研究生，研究方向:食品科學。

基金項目:國家科技支撐計劃課題(項目編號: 2012BAD28B02、2013BAD18B11、2012BAD29B07)。