細菌超聲分散計數儀在分枝桿菌藥物敏感性試驗中的應用價值

蔡杏珊 劉燕文 張院良 陳俊宇 馬尚明 譚耀駒

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·論著·

細菌超聲分散計數儀在分枝桿菌藥物敏感性試驗中的應用價值

蔡杏珊 劉燕文 張院良 陳俊宇 馬尚明 譚耀駒

目的 評估細菌超聲分散計數儀(簡稱“分散儀”)在分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)中的應用價值。方法 使用分散儀和磨菌瓶兩種方法對結核分枝桿菌(MTB)標準株H37Rv和130株臨床分離株進行分散處理，通過肉眼觀察和抗酸染色兩種方法對比這兩種處理方式的分散效果；同時通過平板菌落計數和藥敏試驗來評估分散儀處理對分枝桿菌的活性及藥敏結果的影響。結果 (1)分散效果：130株分枝桿菌臨床分離株中，111株菌落形態為粗糙型，包括MTB 98株，龜膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等共13株，經分散儀和磨菌瓶兩種方法處理后肉眼及顯微鏡觀察，菌落呈現均勻分散的菌株分別占94.59%(105/111)和60.36%(67/111)，差異有統計學意義(χ2=37.28，P<0.05)。(2)菌株活性：上述兩種方法處理后的菌懸液經7H10平板和中性羅氏培養基培養，分別于(12.10±1.85) d和(11.50±2.05) d長出中等大小菌落，差異無統計學意義(t=1.30，P>0.05)。統計上述兩法處理后接種在7H10平板上的菌落數，分別為(215.00±0.95)×104CFU/ml和(207.00±1.10)×104CFU/ml，差異無統計學意義(t=0.93，P>0.05)；羅氏培養基菌落數分別為(178.00±1.31)×104CFU/ml和(185.00±1.75)×104CFU/ml，差異無統計學意義(t=1.01，P>0.05)。(3)藥敏試驗：分散儀處理與磨菌瓶處理菌懸液對異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等一線抗結核藥物的藥敏試驗結果符合率分別為100.00%(130/130)、90.00%(117/130)、96.15%(125/130)、98.46%(128/130)，Kappa值分別為1.00、0.73、0.88、0.90；對阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺等二線抗結核藥物的藥敏試驗結果符合率分別為98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、99.23%(129/130)，Kappa值分別為0.74、0.85、0.79、0.85、0.89、0.91、1.00。兩種處理方法處理后的菌懸液應用MGIT 960液體比例法進行藥敏試驗的報告陽性時間分別為(8.90±0.97) d和(9.30±1.23) d，差異無統計學意義(t=1.02，P>0.05)。結論 在分枝桿菌藥敏試驗的菌懸液制備過程中，對比傳統磨菌瓶處理方法，分散儀處理能更快、更好地實現菌株分散，并且達到菌落分散和濁度檢測一體化，同時不影響菌株的活性和藥敏試驗結果。

分枝桿菌，結核； 超聲處理； 結核，抗多種藥物性

結核分枝桿菌(MTB)的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)是耐藥結核病診斷的金標準。目前在我國各級結核病診斷實驗室中，最常用的耐藥檢測方法仍然是基于固體培養基培養的比例法和MGIT 960的液體比例法[1]，而菌懸液標本的制備是其關鍵步驟[2]。常用的方法是磨菌瓶法：通過振蕩瓶中的玻璃珠與菌落，從而使菌落分散，然后加入含 0.5% Tween-80的生理鹽水進行稀釋，與麥氏1號標準比濁管或比濁儀比濁并稀釋至1個麥氏濁度(MCF)，經稀釋后接種到含藥羅氏管進行耐藥性檢測。上述方法雖然能使菌落分散成菌體，成功完成藥敏檢測，但存在操作繁鎖、耗時長、比濁粗糙，以及生物安全風險等問題。而細菌超聲分散計數儀采用超聲分散的原理使菌落分散，同時自動檢測濁度，最后經人工接種到含藥培養管培養進行耐藥性檢測，具有操作簡單、安全、標準化，耗時短等優勢。筆者分別采用細菌超聲分散計數儀 (簡稱“分散儀”)和傳統的研磨瓶法制備臨床MTB菌株的菌懸液樣本，以評估分散儀在MTB藥敏試驗中的應用價值。

材料和方法

1.菌株來源：實驗中所用的MTB標準菌株H37Rv和130株分枝桿菌臨床分離株均由廣州市胸科醫院檢驗科實驗室提供。

2.主要儀器與試劑：(1)儀器：細菌超聲分散計數儀(超聲功率為19 W；廣東體必康生物科技有限公司生產)、37 ℃恒溫培養箱、4 ℃冰箱、生物安全柜、奧林巴斯光學顯微鏡、Eppendorf 微量移液器、BD960全自動快速分枝桿菌培養儀。(2)試劑耗材：磨菌瓶、直徑9 cm平板、平板封口膜、7H9培養基、7H10培養基、羅氏中性培養基、接種環、生理鹽水、0.5% Tween-80生理鹽水、1.5 ml Eppendorf管、超聲分散專用試管、載玻片、鏡油、Baso抗酸染色液。

3. 分散儀分散效果試驗：H37Rv標準株和130株分枝桿菌臨床分離株均采用接種環挑取羅氏培養基內菌落約一環，放入預先加有2 ml生理鹽水的超聲分散專用試管中，然后將該試管放入分散儀中進行超聲分散：超聲5 s，間隔5 s，持續1 min。根據儀器提示加入相應體積稀釋液，將菌懸液稀釋至1 MCF(1 mg/ml)。取同濃度磨菌瓶研磨的菌懸液樣本，肉眼觀察對比這兩種不同方式處理后菌懸液的分散效果。用生理鹽水將分散儀和研磨瓶分別處理制備的1 MCF菌懸液進行10倍梯度稀釋，直至10-4mg/ml，然后各取0.1 ml菌液進行抗酸染色。根據肉眼觀察和顯微鏡觀察兩種方法來評價不同處理方式的分散效果。

4.分散儀分散后菌株活性試驗：分散儀和磨菌瓶均對H37Rv標準株和130株分枝桿菌臨床分離株進行分散處理，制備濁度為1 MCF的菌懸液樣本，再用生理鹽水對菌懸液進行10倍梯度稀釋，直至10-3mg/ml，然后分別取100 μl菌懸液接種至7H10固體培養基平板和中性羅氏培養基上。接種時用接種環將菌液均勻涂布于平板和羅氏培養基上，最后將兩種培養基置于37 ℃恒溫培養箱中培養。培養過程中定期觀察菌落生長狀態，待14 d菌落生長至合適大小時進行菌落計數，并統計分析結果。

5.分散儀對藥敏試驗結果的影響：分散儀和磨菌瓶均對H37Rv標準株和130株分枝桿菌臨床分離株進行分散處理，參照文獻[3]進行藥敏試驗，以評估兩種分散處理方法對分枝桿菌藥敏試驗結果的影響。一線藥物(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇)的藥敏試驗采用 MGIT 960 法，待儀器自動報告結果時，記錄報陽時間并分析結果；二線藥物(阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺)采用傳統固體比例法進行藥敏試驗，于30 d時統計菌落數并分析結果。

A：分散儀分散(抗酸染色 ×1000)；B：研磨瓶分散(抗酸染色 ×1000)圖2 不同分散方式處理后的結核分枝桿菌H37Rv標準株菌懸液抗酸染色鏡檢結果

6.質量控制：采用H37Rv標準菌株作為分散儀和磨菌瓶處理的分散菌落，菌懸液接種7H10平板及羅氏培養基用以驗證處理后菌懸液的活性，接種含藥培養基以驗證藥敏試驗的準確性，并以其結果作為本研究的質量控制。

7.統計學分析：采用SPSS 19.0軟件進行分析。應用卡方檢驗對分散儀和磨菌瓶處理后菌懸液均勻的菌株百分率進行比較；對兩法處理后接種培養基的菌落數和報告陽性時間進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義；對兩法處理后的菌液藥敏培養結果進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，Kappa≥0.75認為兩者一致性較好。

結 果

1號和2號管均為磨菌瓶處理后的菌懸液；3號管為分散儀分散后的菌懸液圖1 磨菌瓶和分散儀處理后菌懸液分散效果的比較

1.分散效果：應用分散儀和磨菌瓶兩種處理方式對130株分枝桿菌臨床分離株及H37Rv標準株進行處理，肉眼觀察結果表明，分散儀分散的菌液更均勻，無明顯大的菌落顆粒；而磨菌瓶研磨處理后的菌液中存在明顯較大的菌落顆粒，見圖1。

抗酸染色鏡檢結果表明，分散儀分散后的菌懸液菌體分散得更均勻，無明顯的菌體聚集現象，而研磨瓶處理后的菌懸液存在明顯的菌體聚集現象，見圖2。

130株臨床分離株中，有111株菌落形態呈粗糙型，包括MTB 98株，龜膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等共13株；在分散儀和磨菌瓶處理后肉眼及鏡下所見的菌落呈現均勻分散的菌株分別占94.59%(105/111)和60.36%(67/111)，差異有統計學意義(χ2=37.28，P<0.05)。19株菌落形態呈光滑濕潤型的分枝桿菌經上述兩種方法處理后肉眼及顯微鏡所見的菌落全部呈均勻分散。

2.菌株活性驗證：將分散儀和磨菌瓶分別處理后的130株臨床分枝桿菌分離株菌懸液接種在7H10米氏平板和羅氏培養基上，分別于(12.10±1.85) d和(11.50±2.05) d長出中等大小菌落，兩處理方法的報告陽性時間差異無統計學意義(t=1.30，P>0.05)。統計上述兩法處理后接種在7H10平板上的菌落數，分別為(215.00±0.95)×104CFU/ml和(207.00±1.10)×104CFU/ml，差異無統計學意義(t=0.93，P>0.05)；羅氏培養基菌落數分別為(178.00±1.31)×104CFU/ml和(185.00±1.75)×104CFU/ml，差異無統計學意義(t=1.01，P>0.05)。

3.藥敏試驗結果：通過分散儀和磨菌瓶這兩種處理方式完成對MTB標準菌株H37Rv和分枝桿菌臨床分離株的菌懸液制備，然后進行藥敏試驗。結果表明，分散儀處理與磨菌瓶處理比較，對于異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等一線抗結核藥物的藥敏試驗結果符合率分別為100.00%(130/130)、90.00%(117/130)、96.15%(125/130)、98.46%(128/130)，Kappa值分別為1.00、0.73、0.88、0.90，見表1；對阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺等二線抗結核藥物的藥敏試驗結果符合率分別為98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、99.23%(129/130)，Kappa值分別為0.74、0.85、0.79、0.85、0.89、0.91、1.00，見表2。同時，以上兩種處理方法處理后的菌懸液應用MGIT 960液體比例法進行藥敏試驗的報告陽性時間分別為(8.90±0.97) d和(9.30±1.23) d，差異無統計學意義(t=1.02，P>0.05)。

討 論

超聲波是一種頻率高于20 000 Hz的聲波，已廣泛用于診斷學、治療學、工程學、生物學等領域，并取得巨大的成就。本研究所用的細菌超聲分散計數儀以液體為媒介，通過超聲波在液體中的“空化”作用，將液體中聚集成團的菌落進行分散和解團聚，從而達到分散細菌的作用。小功率的超聲有分散作用而無損于細菌體，但大功率的超聲可使細菌及細胞破碎。筆者從分散儀對分枝桿菌的分散效果、細菌活性和耐藥性的影響等方面探討其在分枝桿菌處理過程中的應用價值。

分散儀對試管內菌落超聲5 s，間隔5 s，持續1 min，與傳統磨菌瓶分散處理方式相比，分散儀對菌落形態為粗糙型的分枝桿菌處理具有明顯的分散效果，能均勻分散的菌株占94.59%，大于磨菌瓶處理的60.36%；在菌株活力方面，兩法處理后接種在7H10和羅氏培養基上的菌落數相接近，菌落的生長時間也沒有差異；兩法處理后所做的11種藥物的耐藥性檢測結果一致性也很好。研究表明，分散儀不但可以很好地分散分枝桿菌，而且對細菌沒有造成損傷，對菌株的活性和耐藥性無明顯影響，同時操作更簡便，自動分散，同步實現分散濁度，整個分散過程在密閉空間內完成，給操作人員提供更好的安全保障。

分子檢測方法是目前在臨床MTB耐藥檢測中比較流行的檢測方法[4-6]。該方法的主要優點是快速、方便。但還存在一些缺點，如檢測敏感度低，不能同時檢測多種耐藥突變基因等。傳統的MTB藥敏試驗技術成熟，能全面檢測出針對多種不同藥物具有耐藥性的菌株，但該方法操作復雜，操作環境相對開放，實驗過程中產生的氣溶膠對操作人員的生命安全存在潛在威脅，且實驗周期較長，通常4～8周才能得到結果。在傳統藥敏試驗的前期菌懸液制備階段，通過分散儀來代替傳統磨菌瓶研磨處理，更能保證安全、高效和標準化的操作，使實驗過程更加規范化和系統化。

表1 分散儀和磨菌瓶處理菌懸液進行一線抗結核藥物藥敏試驗結果的比較(株)

表2 分散儀和磨菌瓶處理菌懸液進行二線抗結核藥物藥敏試驗結果的比較(株)

[1] 申曉娜,趙雁林,肖和平.結核分枝桿菌藥物敏感性表型檢測的研究進展.中國防癆雜志,2013,35(6):463-467.

[2] 中國防癆協會. 結核病診斷細菌學檢驗規程. 中國防癆雜志,1996, 18(2):127-134．

[3] 趙雁林,逄宇. 結核病實驗室檢驗規程. 北京：人民衛生出版社, 2015.

[4] Therese KL, Jayanthi U, Madhavan HN. Application of nested polymerase chain reaction (nPCR) using MPB 64 gene primers to detectMycobacteriumtuberculosisDNA in clinical specimens from extrapulmonary tuberculosis patients. Indian J Med Res, 2005, 122(2): 165-170.

[5] Marín M, García de Viedma D, Ruíz-Serrano MJ, et al. Rapid direct detection of multiple rifampin and isoniazid resistance mutations inMycobacteriumtuberculosisin respiratory samples by real-time PCR. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(11): 4293-4300.

[6] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010, 363(11): 1005-1015.

(本文編輯：李敬文)

Value of the bacterial ultrasonic dispersion counter applicated in mycobacterial drug susceptibility testing

CAIXing-shan,LIUYan-wen,ZHANGYuan-liang,CHENJun-yu,MAShang-ming,TANYao-ju.

ClincalLaboratory,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANYao-ju,Email:gzchtan@163.com

Objective To evaluate the application of the bacterial ultrasonic dispersion counter (indicated as instrument below) in mycobacterial drug susceptibility testing. MethodsMycobacteriumtuberculosisH37Rv and 130 strains of clinical isolates were de-clumped by both declumping instrument and bacterial clusters. The de-clumping efficiencies of these two methods were compared by visual observation and acid-fast staining, while the effect of de-clumping instrument on activity and drug sensitivity of Mycobacterium was evaluated using the plate count and drug susceptibility test, respectively. Results (1) De-clumping effect. Of the 130 strains, 111 were rough mycobacterial strains, including 98Mycobacteriumtuberculosisstrains and 13 non-tuberculosis mycobacterium strains such asMycobacteriumchelonei,MycobacteriasmegmatisandMycobacteriumkansasii, et al; evaluated by visual observation and microscopic examination, homogenous declumping of the bacterial clusters were 94.59% (105/111) and 60.36% (67/111) strains after being treated with declumping instrument and bacterial clusters, respectively, the difference was statistically significant (χ2=37.28,P<0.05). (2) Viability of strain. After being processed by 7H10 and L?wenstein-Jensen media for (12.10±1.85) days and (11.50±2.05) days, sizes of bacterial colonies of the bacterial suspension treated with the above two methods showed no significant difference (t=1.30,P>0.05). Numbers of bacterial colonies on 7H10 of the two bacterial suspensions were (215.00±0.95)×104CFU/ml and (207.00±1.10)×104CFU/ml, respectively, there was no statistically significant difference (t=0.93,P>0.05); so was the difference on the L?wenstein-Jensen media ((178.00±1.31)×104CFU/ml vs. (185.00±1.75)×104CFU/ml,t=1.01,P>0.05). (3) Drug susceptibility testing. The coincident rates of bacterial suspensions treated with de-clumping instrument and bacterial clusters to first-line drugs, such as isoniazide, streptomycin, rifampicin and ethambutol were 100.00% (130/130), 90.00% (117/130), 96.15% (125/130) and 98.46% (128/130) withKappavalues of 1.00, 0.73, 0.88 and 0.90, respectively; while the coincident rates to second-line drugs, such as amikacin, levofloxacin, moxifloxacin, isoniazid-aminosalicylate, rifabutine, protionamide and linezolid were 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130) and 99.23% (129/130) withKappavalues of 0.74, 0.85, 0.79, 0.85, 0.89, 0.91 and 1.00, respectively. The positive times of the two bacterial suspensions treated with drug sensitive test by MGIT 960 liquid proportion method were (8.90±0.97) days and (9.30±1.23) days, there was no statistically significant difference (t=1.02,P>0.05). Conclusion Compared to the traditional mechanical grinding, the instrument helps to achieving faster and better de-clumping effects in the process of preparing bacterial suspensions for mycobacterial drug susceptibility testing. It could also achieving the integration of colonies dispersion and turbidity detection without affecting the bacterial viability or drug susceptibility.

Mycobacteriumtuberculosis; Sonication; Tuberculosis, multidrug-resistant

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.11.014

510095 廣州市胸科醫院檢驗科

譚耀駒，Email:gzchtan@163.com

2016-08-31)