中藥復方牛貝消核提取物治療結核病相關靶標的研究

凌彥博 梁艷 王小美 王蘭 張俊仙 陽幼榮 白雪娟 陳實兵 劉軍 楊春瑋 羅華鋒 劉光陵 吳雪瓊

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·論著·

中藥復方牛貝消核提取物治療結核病相關靶標的研究

凌彥博 梁艷 王小美 王蘭 張俊仙 陽幼榮 白雪娟 陳實兵 劉軍 楊春瑋 羅華鋒 劉光陵 吳雪瓊

目的 研究中藥復方牛貝消核提取物治療結核病的相關靶標，闡明其作用機制。方法 9只小鼠分為正常組、結核模型組和牛貝消核治療組，每組3只。結核模型組和牛貝消核治療組經尾靜脈注射5×105CFU(菌落形成單位)的結核分枝桿菌H37Rv標準株的懸液感染7 d后，牛貝消核治療組用牛貝消核水提取物進行灌胃。治療12周后，殺鼠采血至抗凝管，提取小鼠全血總RNA，反轉錄后與小鼠基因表達譜芯片雜交，應用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數據庫分析、比較各組間的基因表達結果，以差異變化倍數≥2.0作為基因表達明顯上調或下調的判斷標準。結果 結核模型組和正常組基因表達譜比較共有差異表達基因5647條，其中2898條上調，2749條下調。結核模型組和牛貝消核治療組比較共有差異表達基因7051條，3454條基因上調，其中涉及多個免疫相關因子；3597條基因下調，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路明顯抑制下調。結論 牛貝消核提取物具有明顯的免疫調節作用，具有下調JNK信號通路、抑制炎癥的作用。

中草藥； 結核； 藥理作用分子作用機制； 基因表達譜

結核病是由結核分枝桿菌(Mtb)引起的呼吸道傳染病。據世界衛生組織估計，全世界約有1/3的人口被Mtb感染，2013年全球新發結核病患者900萬例，150萬例死于結核病[1]。我國是世界22個結核病高負擔國家之一，第五次全國結核病流行病學抽樣調查結果表明，我國現有結核病患者500萬例，對一線抗結核藥物的耐藥率達36.8%，耐多藥率達6.8%。因此，結核病耐藥問題是目前亟待解決的難點之一。

中醫藥是我國傳統醫學的精髓代表，中藥治療的最大優勢是多成分、多靶點、多系統、低毒性地發揮綜合作用。結核病在中醫稱之為癆病，傳統醫學認為該病的產生有內外兩方面因素，外因為感染癆蟲，內因為正氣虛弱、氣血不足、陰精耗損所致。由此可見，癆蟲是發病的因素，正氣虛弱是發病的基礎，體虛感染癆蟲是形成本病的關鍵[2]。傳統醫學針對結核病產生的內外因進行治療具有獨特的優勢，“一則補其虛，復其真元；一則殺其蟲，以絕其根本”[3]。因此，中藥治療結核病具有其自身獨特的優勢。

牛貝消核是結合長期的臨床實踐和結核病自身的發病特點，總結出的一個由川貝母、桔梗、白芨、牛蒡子、魚腥草、糯米六味藥配伍而成的民間經驗方，其中川貝母、白芨二藥相輔作為君藥，魚腥草、桔梗、牛蒡子三味俱為臣藥，以補脾胃、益肺氣的糯米為佐使藥。本方通過6 種中藥的合理配伍、相互作用，使其達到清熱解毒、軟堅化結及滋陰潤肺、止咳化痰、托舊生新、消腫止血、抗菌消炎的功效，臨床可用于Mtb感染引起的各型肺結核，尤其是耐多藥結核病和廣泛耐藥結核病。經過臨床驗證及動物實驗證明，本中藥復方具有抑制或殺滅Mtb、緩解化療藥物不良反應、有效緩解結核中毒癥狀、增強機體免疫力、降低耐藥結核病發生率的優點，安全、無不良反應[ 4-6]。因此，本研究采用中藥復方牛貝消核提取物治療小鼠結核模型后，檢測基因表達譜并觀察其變化，旨在尋找該藥物影響疾病發生和轉歸的關鍵信號通路和關鍵靶基因，以闡明其作用機制。

材料和方法

1.實驗動物與主要試劑：5～6周雌性BALB/c小鼠購自軍事醫學科學院，體質量20～22 g，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級。中藥牛貝消核水提取物由廣東奇方藥業有限公司制備。基因表達譜芯片購自安捷倫公司(Agilent，USA)。

2.小鼠結核模型的制備：9只小鼠按照數字表法隨機分入下列3個實驗組：(1)正常對照組：作為空白對照組，每天分別對各組小鼠采用0.5 ml蒸餾水進行灌胃；(2)結核模型組：小鼠經尾靜脈注射5×105CFU(菌落形成單位)的結核分枝桿菌H37Rv標準株。感染7 d后，每天分別對各組小鼠采用0.5 ml蒸餾水進行灌胃；(3)牛貝消核治療組：小鼠經尾靜脈注射5×105CFU的結核分枝桿菌H37Rv標準株，感染后7 d，將水提取物牛貝消核60 mg溶于10 ml滅菌蒸餾水中，每天分別對該組小鼠采用牛貝消核溶液0.5 ml進行灌胃。實驗過程中，每周對小鼠稱重1次，6周后摘除眼球殺鼠采血，放在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混勻。

3.小鼠全血總RNA的提取和純化：采用RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)對小鼠全血進行總RNA的提取和純化；RNA的質量檢測使用NanoDrop ND-1000(Thermal公司，美國)超微量紫外檢測儀，使RNA的A260/A280在1.80～2.10之間。

4.小鼠基因表達譜芯片檢測：提純的總RNA在上?？党缮锛夹g有限公司進行基因表達譜芯片檢測。具體方法如下：反轉錄的cDNA并用Cy3熒光素標記后，分別與4×44 K基因表達譜芯片在42 ℃條件下雜交16～20 h，將芯片放入安捷倫微陣列芯片掃描儀(Agilent Microarray Scanner)，讀取數據。

5.數據處理和分析：采集的數據采用基因組百科全書(KEGG數據庫)和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數據庫(Ingenuity公司，美國)進行分析。以差異變化倍數≥2.0作為基因表達明顯上調或下調的判斷標準。

結 果

一、差異表達的基因

結核模型組和正常組基因表達譜比較，共有差異表達基因5647條，其中2898條上調，2749條下調；結核模型組和牛貝消核治療組比較，共有差異表達基因7051條，其中3454條上調，3597條下調。差異倍數大的部分基因及其分子功能注釋見表1。

二、中藥治療前后差異表達基因的基因本體(GO)分析

與正常組比較，結核模型組小鼠表達上調的基因主要參與了下列過程：1278個上調基因參與了細胞過程的調節，1092個參與了代謝過程的調節，959個參與了初級代謝過程的調節，949個參與了細胞代謝過程，847個參與了生物調節，817個參與了大分子代謝過程，813個參與了生物學過程的調節，763個對細胞過程的調節，752個參與了大分子代謝過程，622個氮化合物代謝過程。

與正常組比較，結核模型組小鼠表達下調的基因主要參與了下列過程：1258個上調基因參與了細胞過程，940個參與了代謝過程，933個參與了生物調節，889個參與了生物過程的調節，839個參與了細胞過程的調節，795個參與了初代謝過程，773個參與了細胞代謝過程，871個對刺激物應答，819個參與了大分子代謝過程，739個多細胞生物過程。

表1 牛貝消核治療后表達明顯上調的部分基因在結核模型組、牛貝消核治療組與正常組比較的結果及其分子功能注釋

表2 牛貝消核治療后表達明顯下調的部分基因在結核模型組、牛貝消核治療組與正常組比較的結果及其分子功能注釋

與結核模型組比較，牛貝消核治療組表達上調的基因主要參與了下列過程：1612個上調基因參與了細胞過程，1207個參與了代謝過程，1188個參與了生物調節，1134個參與了生物過程的調節，1055個參與了細胞過程的調節，1021個參與了一級代謝過程，985個參與了細胞代謝過程，871個對刺激物應答，819個參與了大分子代謝過程，739個多細胞生物過程。

與結核模型組比較，牛貝消核提取物治療組表達下調的基因主要參與了下列過程：1421個下調基因參與了細胞過程，1163個參與了代謝過程，986個參與了一級代謝過程，974個參與了細胞代謝過程，927個參與了生物調節，888個參與了生物過程的調節，845個參與了細胞代謝過程，773個參與大分子代謝過程，695個參與了細胞大分子代謝過程，680個參與了應激反應。

三、信號通路的分析預測

應用IPA數據庫對表達譜結果進行信號通路分析預測發現，許多信號通路均受到影響，但結核模型組與正常組比較，c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路明顯上調；而牛貝消核治療組與結核模型組相比，JNK通路明顯下調，JNK通路分析結果見圖1。

上圖為牛貝消核治療組與結核模型組比較，下圖為結核模型組與正常組比較，圖中深綠色代表大幅下調，淡綠色代表小幅下調，藍色代表預測可能下調，橙色代表大幅上調，粉色代表小幅上調 圖1 應用IPA數據庫分析JNK通路基因差異表達結果

討 論

本研究通過測定中藥復方牛貝消核提取物治療后小鼠轉錄組學基因表達譜的變化，緊密結合中藥復方整體作用的特點，開展中藥功能靶點的研究，旨在發現和揭示對結核病治療和轉歸起關鍵作用的信號通路與關鍵基因靶點網絡，在整體層面闡釋中藥的作用機制，為方劑制劑的研究與應用提供理論依據，為復方的設計與優化及中西醫結合治療奠定實驗基礎。

本研究在小鼠Mtb感染后表達明顯上調和下調的部分基因，在牛貝消核提取物治療后發生了明顯的變化：(1)牛貝消核治療后IL-17、TNF、TNFAIP6、CXCL1、CXCL2和CXCL9的表達均明顯上調，抗結核感染的保護性免疫依賴于細胞因子調節的T細胞和巨噬細胞活化，Th17細胞是一個分泌IL-17 的CD4+T細胞亞群，IL-17也可由CD8+T細胞、γδ T 細胞和NK T細胞等細胞產生，Th17誘導或促進Th1細胞的抗結核免疫應答，在宿主抗結核感染中發揮重要作用[7]；TNF-α 是由巨噬細胞、樹突狀細胞或T細胞分泌的細胞因子，與IFN-γ具有協同作用，激活被Mtb感染的巨噬細胞，促進對胞內病原菌的殺傷功能，募集巨噬細胞和淋巴細胞遷移至感染部位，促進肉芽腫的形成，目前研究發現應用TNF-α抑制劑可能導致Mtb播散[8]；TNF-α誘導蛋白6(tumor necrosis factor alpha induced protein 6，Tnfaip6)是透明質酸結合蛋白家族的一個新成員，可誘導炎性細胞因子(TNF-α、IL-1)分泌，可能在炎癥發生期間參與細胞-細胞、細胞-基質間的相互作用[9]。CXCL1 [Chemokine (C-X-C motif) ligand 1]、CXCL2和CXCL9均屬于CXC趨化因子家族的小分子細胞因子，CXCL1趨化因子是由巨噬細胞、中性粒細胞和上皮細胞表達的，有細胞趨化作用；CXCL2是專門負責單核細胞募集和遷移的化學因子；CXCL9是T細胞趨化因子，都在結核肉芽腫的形成中發揮重要作用[10]；目前研究顯示，這些免疫基因下調可能與疾病嚴重程度相關[11]。因此，本研究結果證明牛貝消核提取物能夠很好地調動機體的抗結核細胞免疫。(2)呼吸道中固有免疫應答的主要因子α防御素相關序列2(defensin, alpha, related sequence 2，Defa-rs2)表達明顯上調[12]；SPARC/骨粘連蛋白、CWCV和KAZAL樣域蛋白多糖1[sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan 1，即睪丸蛋白聚糖1(SPOCK1)]表達明顯上調，激活JAK-STAT信號通路，誘導感染的巨噬細胞凋亡[13]；泛素連接酶PDZRN3(PDZ domain containing RING finger protein 3)表達上調，自噬作用增強[14]；GTP酶DNM1 (dynamin 1)表達明顯上調，促進了內呑作用[15]，這些都加強了牛貝消核的抗結核作用。(3)一個免疫球蛋白分子由2條輕鏈(L鏈)和2條重鏈(H鏈)通過二硫鍵連接而成，結核感染后抗體輕鏈和重鏈均增高，說明抗體水平增高，Th2型免疫增強，這與目前研究的結核病免疫機制是一致的，結核病患者由Th1型向Th2型免疫轉化[16]。牛貝消核治療后抗體輕鏈和重鏈均明顯下降，說明牛貝消核能在小鼠體內激發Th1相關的免疫應答，抑制Th2相關的免疫應答，使Th2向Th1轉化，而發揮有效的治療作用。(4)感染后炎癥通路的調控因子如Foxp1(forkhead box P1)、Eif4g3(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 3)和Retnlg表達明顯上調，調控促炎細胞因子的分泌，促進炎癥反應[17]；而中藥治療后這些因子表達明顯下調，可能減輕炎癥及炎癥損傷，控制了結核病的進展。上述許多基因和蛋白與結核病的關系目前國內外未見研究報道，筆者首次發現結核感染后這些基因和蛋白參與了結核炎癥反應。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號轉導通路, 是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的一個分支，它在細胞周期、生殖、凋亡和細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用。目前的研究已證明，當細胞受各種各樣的刺激(如生長因子、脂多糖、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1等)發生應激時可激活JNK表達特異性蛋白酶和細胞因子，而在慢性炎癥性疾病中發揮重要作用[18]；此外，JNK具有促進細胞凋亡的能力[19]。JNK信號通路功能失調可造成慢性炎癥性疾病[20]。本研究首次發現Mtb感染小鼠后，JNK信號轉導通路明顯上調，提示JNK信號轉導通路可能是結核細胞因子網絡的重要作用靶標，它一方面促進炎癥反應；另一方面促進小鼠巨噬細胞發生凋亡，殺死寄生于巨噬細胞內的Mtb，從而阻止Mtb在體內的播散[21]；但感染初期大量巨噬細胞凋亡可能不利于抗原提呈，而使機體難以誘導細胞免疫應答[22]。由此可見，JNK信號通路在結核病的發生、發展中也發揮了關鍵作用，通過對炎癥反應的正負反饋調控作用，使炎癥反應體系達到一個新的動態平衡水平。

本研究應用牛貝消核提取物治療感染Mtb的小鼠后，發現其JNK通路被明顯抑制，逆轉了Mtb感染導致的JNK通路上調，提示牛貝消核提取物作用于JNK信號通路并阻抑該通路的功能，減弱細胞對應激抗原的應答，抑制Mtb引起的炎癥反應；但它也抑制了巨噬細胞的凋亡，可能導致Mtb在胞內存活和繁殖[21]。因此，JNK通路的調控呈現復雜性和多面性。本研究試圖闡明JNK信號通路的轉導及調節在結核炎癥反應的動態平衡中發揮重要作用，通過調節信號轉導網絡調控的異常也可能有益于結核病慢性炎癥的控制，可能成為結核病有效治療的新靶標。

總之，牛貝消核提取物具有明顯的免疫調節作用，通過加強巨噬細胞的吞噬、抑菌作用，提高Th1型免疫，抑制Th2型免疫，下調JNK通路抑制炎癥反應，發揮抗結核治療作用。本研究運用轉錄組學的方法發現了中藥復方牛貝消核在治療結核病的可能的作用靶標JNK通路，對未來研發針對該分子靶標的抗結核新藥具有指導意義。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2014. Geneva: World Health Organization, 2014.

[2] 趙霞，趙燁，朱國強. 中藥在治療肺結核中的作用及地位. 實用中醫內科雜志，2005，19 (6):506-507.

[3] 劉秋瓊，高玉橋，林秋曉，等.中藥治療肺結核的研究進展.中藥材, 2007, 30(11):1478-1481.

[4] 陳實兵. 治療結核病的中藥組合物：中國，ZL200710048778.X. 2011-03-16.

[5] 王小美. 中藥牛貝消核體內外抑菌作用的研究. 南京：南京中醫藥大學，2014.

[6] 陳丹. 抗結核中藥制劑牛貝消核的免疫學與一般藥理學研究. 南京：南京中醫藥大學，2014.

[7] 劉麗改，倫文輝. Th17細胞在HIV合并結核分枝桿菌感染免疫中的作用研究進展. 中華實驗和臨床感染病雜志(電子版)，2012，6(1):54-56.

[8] Hess S, Hospach T, Nossal R, et al. Life-threatening dissemi-nated tuberculosis as a complication of TNF-a blockade in an adolescent. Eur J Pediatr, 2011, 170 (10): 1337-1342.

[9] Lee TH, Wisniewski HG, Vilcek J. A novel secretory tumor necrosis factor-inducible protein (TSG-6) is a member of the family of hyaluronate binding proteins, closely related to the adhesion receptor CD44. J Cell Biol, 1992, 116(2):545-557.

[10] Algood HMS, Chan J, Flynn JL. Chemokines and tuberculosis. Cytokine Growth Factor Rev, 2003, 14(6): 467-477.

[11] Hasan Z, Jamil B, Khan J, et al. Relationship between circulating levels of IFN-γ, IL-10, CXCL9 and CCL2 in pulmonary and extrapulmonary tuberculosis is dependent on disease severity. Scand J Immunol, 2009, 69(3):259-267.

[12] Cakir E, Torun E, Gedik AH, et al. Cathelicidin and human β-defensin 2 in bronchoalveolar lavage fluid of children with pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2014, 18(6):671-675.

[13] Shu YJ, Weng H, Ye YY, et al. SPOCK1 as a potential cancer prognostic marker promotes the proliferation and metastasis of gallbladder cancer cells by activating the PI3K/AKT pathway. Mol Cancer, 2015, 14:12.

[14] Manzanillo PS, Ayres JS, Watson RO, et al. The ubiquitin ligase parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature, 2013, 501(7468):512-516.

[15] Fà M, Staniszewski A, Saeed F, et al. Dynamin 1 is required for memory formation. PLoS One, 2014, 9(3): e91954.

[16] 任濤，金美玲，蔡映云，等. 結核分枝桿菌感染與Th1/Th2免疫應答的研究進展. 國外醫學 內科學分冊, 2003, 30(9): 388-391.

[17] Asano T, Sakosda H, Fujishiro M, et al. Physiological significance of resistin and resistin-like molecules in the inflammatory process and insulin resistance. Curr Diabetes Rev, 2006, 2(4):449-454.

[18] Liu J, Yan J, Jiang S, et al. Site-specific ubiquitination is required for relieving the transcription factor Miz1-mediated suppression on TNF-α-induced JNK activation and inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(1):191-196.

[19] Lin A. Activation of the JNK signaling pathway: Breaking the brake on apoptosis. Bioessays, 2003, 25(1):17-24.

[20] 黎增輝，廖愛軍.JNK信號通路. 國際病理科學與臨床雜志，2010，30(3):273-276.

[21] 董偉杰，張萬江. 結核分枝桿菌對感染宿主細胞凋亡的調控作用研究. 新醫學，2012，43(2): 133-136.

[22] 夏飛，劉勝武，魏雅稚，等. 結核分枝桿菌誘導宿主巨噬細胞凋亡機制初探. 中華微生物學和免疫學雜志，2005，25(6): 463-468.

(本文編輯：薛愛華)

The study on the targets of the antituberculosis effect of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe extracts

LINGYan-bo*,LIANGYan,WANGXiao-mei,WANGLan,ZHANGJun-xian,YANGYou-rong,BAIXue-juan,CHENShi-bing,LIUJun,YANGChun-wei,LUOHua-feng,LIUGuang-ling,WUXue-qiong.

*ArmyTubercu-losisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,InstituteforTuberculosisResearch,The309thHospitalofPLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

Objective To study the targets of the anti-tuberculosis effect of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe extracts, and analyze its mechanism. Methods Nine mice were divided into three groups: Normal control group, TB model group and Nubeixiaohe treatment group, 3 mice each group.The mice in TB model group and Nubeixiaohe treatment group were injected via the tail vein with 5×105CFUs ofM.tuberculosis(Mtb) H37Rv. At 7 days after infection, the mice in Nubeixiaohe treatment group were administered with Niubeixiaohe extracts by gavage for 12 weeks. Mice were collected the bloods in anticoagulative tube. The total RNAs of mouse whole bloods were extracted, reversed transcription, and then hybridized with gene expression chips. The data were analyzed with IPA (Ingenuity Pathway Analysis) database to find the difference of gene expression between different groups. More than 2.0-fold of gene expression difference was considered as the criteria of significantly upregulation or downregulation. Results There were 5647 genes differentially expressed between TB model group and normal control group (2898 upregarded expression and 2749 downregarded expression). Of 7051 genes differentially expressed between TB model group and Nubeixiaohe treatment group, 3454 were up-regulated expression, in which more genes involve multiple immune-related factors; 3597 were down-regulated expression, in which the genes in c-Jun N-terminal kinase (JNK) signal pathway were significantly down-regulated in treatment group. Conclusion Niubeixiaohe extracts had immunomodulatory related effects, and had a role of anti-inflammation by inhibiting JNK pathway.

Drugs, Chinese Herbal； Tuberculosis; Molecular mechanisms of pharmacological action； Gene expression profiling

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.006

北京市十病十藥研發項目(Z141100002214002)

100091 北京，解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室 結核病診療新技術北京市重點實驗室(凌彥博、梁艷、王小美、王蘭、張俊仙、陽幼榮、白雪娟、陳實兵、劉光陵、吳雪瓊)；廣東奇方藥業有限公司(劉軍、楊春瑋、羅華鋒)

吳雪瓊，Email：xueqiongwu@139.com

2015-11-23)