應用PCR-反向點雜交技術快速檢測結核分枝桿菌耐藥突變基因

彭亦平 宗佩蘭 辛茶香 熊國亮 胡群芳 袁小蘭 史安良 姚琳 王小路 萬贊燕 吳娟

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·論著·

應用PCR-反向點雜交技術快速檢測結核分枝桿菌耐藥突變基因

彭亦平 宗佩蘭 辛茶香 熊國亮 胡群芳 袁小蘭 史安良 姚琳 王小路 萬贊燕 吳娟

目的 評價PCR-反向點雜交技術在檢測結核分枝桿菌耐藥突變基因中的應用價值。方法 選取2014年8月至2015年12月江西省胸科醫院住院的部分肺結核患者作為研究對象，共1071例。研究對象均送檢了痰液標本，共1071份。所有患者均經病原學或病理學證實，或符合菌陰肺結核診斷標準。采用PCR-反向點雜交技術對研究對象痰標本進行異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)耐藥基因檢測，并以痰培養陽性標本的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測結果作為金標準，來驗證檢測結果的可靠性及評價其檢測效能。結果 PCR-反向點雜交檢測的1071例患者中，596例結核分枝桿菌陽性，陽性率為55.65%。其中，218例(36.58%)檢出H、R、S、E耐藥基因突變，分布于所測13個位點。H、R、S、E最常見突變位點分別位于KatG的315M(82.53%，137/166)、rpoB的S531L(69.50%，98/141)、rpsl的43M(78.65%，70/89)、embB的306M2(55.13%，43/78)和306M1(39.74%，31/78)。433例患者標本同時行結核分枝桿菌培養，培養陽性且同時PCR-反向點雜交檢測陽性157例。以培養及藥敏試驗結果為金標準，PCR-反向點雜交法對H、R、S、E的耐藥檢測經Kappa檢驗具有較好的一致性(Kappa值分別為0.77、0.73、0.66、0.49)；敏感度分別為88.89%(40/45)、79.66%(47/59)、67.57%(25/37)、63.16%(12/19)；特異度分別為91.07%(102/112)、91.84%(90/98)、95.00%(114/120)、91.30%(126/138)。結論 PCR-反向點雜交技術用于結核分枝桿菌耐藥基因檢測較為可靠，對早期臨床用藥具有較好的指導作用。

聚合酶鏈反應； 分枝桿菌，結核； 抗藥性，細菌； 基因

PCR-反向點雜交技術是將PCR技術的高敏感度、反向斑點雜交技術的高特異性和膜芯片技術的高通量3種成熟技術的優勢有效結合的快速基因診斷手段。它可同時檢測4種一線藥物的5個常見耐藥相關基因上13個位點的突變，且簡便快速，可直接采用痰標本進行檢測，8 h即可得出結果。本研究采用PCR-反向點雜交技術，對江西省胸科醫院住院肺結核患者的痰標本進行一線抗結核藥物[異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)]的5個常見耐藥突變基因中的13個位點進行檢測，以了解這些基因突變的發生頻率及分布特點，并以藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)作為金標準進行比較，分析其敏感度、特異度、符合率、陽性預測值、陰性預測值等指標，評價其在結核分枝桿菌快速耐藥檢測中的價值。

對象和方法

1.對象：選取2014年8月至2015年12月江西省胸科醫院住院的部分肺結核患者作為研究對象，共1071例。其中，男723例，女348例，年齡19～85歲。研究對象均送檢了痰液標本，共1071份。所有患者均經病原學或病理學證實，或符合菌陰肺結核診斷標準。

2.儀器與試劑：DA7600基因擴增儀由中山大學達安基因股份有限公司提供；HR40-ⅡA2生物安全柜由青島海爾公司提供；恒溫雜交儀由亞能生物技術(深圳)有限公司提供；PCR-反向點雜交試劑由亞能生物技術(深圳)有限公司提供；分離培養專用酸性羅氏培養基由江西省胸科醫院檢驗科結核分枝桿菌培養室自制。

3.PCR-反向點雜交：(1)DNA提取及PCR擴增：取痰標本3～5 ml，加等量4%NaOH液化20 min，離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心5 min，棄上清；向沉淀中加入1 ml的磷酸鹽緩沖液，混勻，離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心2 min；向沉淀中加入50 μl裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心2 min，留上清液。取出PCR反應管，在管壁上做好標記，離心半徑5 cm，5000 r/min，離心10 s，加入已提取的待測樣品DNA 4 μl。同時取兩管PCR反應管分別加入陽性質控品和陰性質控品DNA，作為產品使用過程的質量控制。按說明書要求進行擴增。(2)雜交、洗膜、顯示：取15 ml塑料離心管，放入標有患者編號的膜條，加入AT液(依說明書，由氯化鈉、檸檬酸鈉、十二烷基硫酸鈉按一定比例配置) 5～6 ml及所有(25 μl)PCR 產物，將蓋擰緊，混勻。將離心管放入沸水浴中加熱10 min，取出離心管，放入分子雜交箱59 ℃雜交1.5 h。取50 ml塑料管，加入40 ml B液(依說明書，由氯化鈉、檸檬酸鈉按一定比例配置)于分子雜交箱或水浴箱中預熱至59 ℃。取出膜條，移至裝有預熱至59 ℃ B液的50 ml管中，于59 ℃輕搖洗滌15 min。按AT液∶POD(鏈霉親和素辣根過氧化物酶)=2000∶1配制孵育液，室溫輕搖孵育30 min，棄去POD 溶液。用AT 液室溫輕搖洗2次，每次5 min。用C 液(檸檬酸鈉)室溫洗膜2 min，同時配制顯色液。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色5～10 min即可觀察結果。

4.細菌培養及藥敏試驗：按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[1],采用改良羅氏培養法及比例法藥敏試驗。

5.統計學分析：采用SPSS 13.0軟件進行分析，PCR-反向點雜交檢測與藥敏試驗對研究對象耐藥檢測結果的比較采用McNemar檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。對PCR-反向點雜交檢測與藥敏試驗檢測結果進行Kappa一致性檢驗，Kappa值≥0.75為兩者的一致性較好，Kappa值為0.4～0.75為一致性一般，Kappa值<0.4為一致性差。符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/檢測對象總例數×100%；敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。

結 果

1.PCR-反向點雜交檢測結果：1071例患者中，596例結核分枝桿菌陽性，陽性率為55.65%。其中，378例(63.42%)未檢出H、R、S、E耐藥基因突變，218例(36.58%)檢出H、R、S、E耐藥基因突變，分布于所測13個位點。檢測顯示，R耐藥140例，耐藥率為23.49%(140/596)；H耐藥160例，耐藥率為26.85%(160/596)，其中6例同時出現315M和-15M突變；S耐藥88例，耐藥率為14.77%(88/596)，其中1例同時出現43M和88M突變；E耐藥76例，耐藥率為12.75%(76/596)，其中2例同時出現306M1和306M2突變。各突變基因位點分布情況見表1。

表1 218例經PCR-反向點雜交檢測發生耐藥基因突變患者突變位點分布情況

注 D516V表示rpoB基因第516密碼子的D突變為V，即天冬氨酸突變為纈氨酸。其他氨基酸含義：G-甘氨酸、H-組氨酸、Y-酪氨酸、S-絲氨酸、L-亮氨酸、W-色氨酸、T-蘇氨酸、N-天冬氨酸。315M及-15M 分別表示katG基因第315密碼子和inhA基因第-15密碼子的突變。43M和88M分別代表rpsL基因第43和88密碼子發生突變。306M1、306M2和306M3代表embB基因第306密碼子發生不同類型的突變

2. PCR-反向點雜交法與固體藥敏耐藥情況比較：433例患者標本同時行結核分枝桿菌培養，培養陽性且同時PCR-反向點雜交檢測陽性157例，藥敏試驗結果顯示耐藥者74例，其中R耐藥59例，耐藥率為37.58%(59/157)；H耐藥45例，耐藥率為28.66%(45/157)；S耐藥37例，耐藥率為23.57%(37/157)；E耐藥19例，耐藥率為12.10%(19/157)。以培養及藥敏試驗結果為金標準，經檢驗兩種不同方法對H、R、S、E的耐藥檢測情況差異無統計學意義，經Kappa一致性檢驗，兩種方法具有較好的一致性。結果見表2。

討 論

目前，臨床上用于結核分枝桿菌耐藥檢測的主要方法是培養法及藥敏試驗，被譽為 “金標準”。但此方法操作復雜、費時，一般需要4～8周，診斷周期長，且培養困難，敏感度低，不能及時指導用藥。隨著分子生物學診斷技術的不斷進步，結核分枝桿菌的耐藥突變基因檢測得到了很快發展。PCR-反向點雜交技術是將PCR技術的高敏感度，反向斑點雜交技術的高特異性和膜芯片技術的高通量3種成熟技術的優勢有效結合的快速基因診斷手段，可同時檢測4種一線藥物的5個常見耐藥相關基因上13個位點的突變。并且，其與培養法及藥敏試驗相比，簡便快速，8 h即可得出結果。

研究表明，大部分結核分枝桿菌耐藥性產生的主要原因是藥物作用靶點的基因發生突變。目前已知的結核分枝桿菌針對一線藥物的耐藥相關基因突變包括：針對R耐藥的rpoB耐藥核心區各堿基；針對H的katG、inhA、ahpC和oxyR基因；針對E的embA、embB和embC基因；針對S的rrs、rpsl和strA基因等[2-4]。

本研究應用PCR-反向點雜交法檢測1071例肺結核患者痰標本，596例結核分枝桿菌基因檢測陽性，陽性率為55.65%；其中，218例發生耐藥基因突變，分布于所測13個位點。H、R、S、E等4種藥物最常見的突變位點分別位于KatG的315M、rpobB的S531L、rpsl的43M、embB的306M2和306M1，與文獻[5-7]報道的基本相符。

在實際應用中，基因芯片技術的結核分枝桿菌耐藥性檢測結果具有較高的可靠性，相關文獻表明其敏感度達85.5%～100%，特異度達100%[8-10]，但所示文獻均以PCR-直接測序為金標準。本研究采用PCR-反向點雜交技術，同時檢測H、R、S、E等4種藥物，并以培養法及藥敏試驗為金標準進行對比。結果顯示，兩種方法檢測結果差異無統計學意義；

表2 PCR-反向點雜交法與藥敏試驗對157例結核分枝桿菌檢測陽性患者耐藥檢測的比較

kappa一致性分析顯示具有中高度一致性，其符合率均在87%以上。由此說明，PCR-反向點雜交技術用于結核分枝桿菌耐藥基因檢測具有可靠性。另外，PCR-反向點雜交技術檢測耐藥基因的特異度均較高(均>90%)，說明其造成耐藥菌誤診的可能性小；但敏感度偏低，尤其是S(67.57%)與E(63.16%)，說明其造成耐藥菌漏診的概率較高。究其原因，可能為每種藥物均有多個耐藥基因及位點，本研究僅針對常見耐藥基因及位點進行了檢測。

綜上所述，PCR-反向點雜交技術用于結核分枝桿菌耐藥基因檢測具有快速、可靠的優點，對早期臨床用藥具有指導作用；但限于檢測基因的不足，造成診斷敏感度不夠高。因此，有必要進一步研究盡可能包含更多突變基因的試驗方法。

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(本文編輯：李敬文)

Rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisresistant genes using PCR reverse dot blotting hybridization

PENGYi-ping,ZONGPei-lan,XINCha-xiang,XIONGGuo-liang,HUQun-fang,YUANXiao-lan,SHIAn-liang,YAOLin,WANGXiao-lu,WANZan-yan,WUJuan.

TheThirdDepartmentofInternal,JiangxiChestHospital,Nanchang330006,China

PENGYi-ping,Email:pyp74@126.com

Objective To explore the value of PCR reverse dot blotting hybridization in detecting drug-resis-tant gene mutation ofMycobacteriumtuberculosis. Methods A total of 1071 inpatients were enrolled from Jiangxi Chest Hospital in interval between August 2014 and December 2015. All patients were with positive pathology or positive pathogeny, or identified by the criteria of pulmonary tuberculosis with negative smear or culture. PCR reverse dot blot hybridization which was used to detectMycobacteriumtuberculosisdrug-resistant genes, which were included (isoniazid (H), rifampin (R), streptomycin (S) and ethambutol (E) in 1071 sputa samples). The results were compared with result of drug susceptibility test, which usually considered as golden standard, and the efficiency was evaluated. Results Of the 1071 cases were detected by using PCR reverse dot blot hybridization, 596 (55.65%) were TB positive, and H, R, S or E mutant genes distributing in 13 loci were found in 218 cases (36.58%). The most common mutant-gene of H, R, S and E wereKatG-315M (82.53%, 137/166),rpoB-S531L (69.50%, 98/141),rpsl-43M (78.65%, 70/89),embB-306M2 (55.13%, 43/78) andembB-306M1 (39.74%, 31/78), respectively. Additionally, 433 clinical samples were tested with TB culture, and 157 cases had obtained positive results in both of TB culture and dot blot hybridization. By using culture and drug sensitivity results as gold standard, PCR reverse dot blot hybridization had excellent consistency in detecting H, R, S and E compared by adoptingKappatest (Kappaindex were 0.77, 0.73, 0.66 and 0.49, respectively). The sensitities were 88.89% (40/45), 79.66% (47/59), 67.57% (25/37) and 63.16% (12/19), and the specificities were 91.07% (102/112), 91.84% (90/98), 95.00% (114/120) and 91.30% (126/138), respectively. Conclusion PCR reverse dot blot hybridization was reliable to detect the drug-resistant gene mutation ofMycobacteriumtuberculosis, and it was helpful in drug usage guidance.

Polymerase chain reaction;Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, bacterial; Genes

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.004

江西省科技計劃(20151BBG70124)

330006 南昌，江西省胸科醫院內三科(彭亦平、胡群芳、史安良、姚琳、王小路、萬贊燕、吳娟)，內一科(宗佩蘭)，檢驗科(辛茶香、熊國亮)，科教科(袁小蘭)

彭亦平，Email: pyp74@126.com

2016-04-29)