胸腔積液γ-干擾素釋放試驗對老年結核性胸膜炎的診斷價值

付洪義 章志華 劉寧 池躍鵬 劉會 張勤鳳 宋韜

?

·論著·

胸腔積液γ-干擾素釋放試驗對老年結核性胸膜炎的診斷價值

付洪義 章志華 劉寧 池躍鵬 劉會 張勤鳳 宋韜

目的 評價胸腔積液γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)對老年結核性胸膜炎(pleural effusion，PE)的診斷價值。方法 選取2013年1月至2015年7月在河北省胸科醫院結核內科疑似為結核性胸膜炎的133例老年住院患者，同時進行胸腔積液和外周血的IGRA，依據最終結果將患者分為確診結核性胸膜炎組(簡稱“確診組”)、臨床診斷結核性胸膜炎組(簡稱“臨床診斷組”)、非結核性胸膜炎組，比較各組胸腔積液和外周血IGRA的敏感度與特異度、陽性預測值與陰性預測值。結果 13例(9.77%)確診為結核性胸膜炎，63例(47.37%)臨床診斷為結核性胸膜炎，57例(42.86%)為非結核性胸膜炎。胸腔積液IGRA的敏感度為90.79%(69/76)，明顯高于外周血的67.11%(51/76)，差異有統計學意義(χ2=12.826，P<0.001)；胸腔積液IGRA的特異度為98.25%(56/57)，明顯高于外周血的84.21%(48/57)，差異有統計學意義(χ2=7.015，P=0.016)；胸腔積液IGRA的陽性預測值為98.57%(69/70)，高于外周血的85.00%(51/60)，差異有統計學意義(χ2=8.380，P<0.001)；胸腔積液IGRA的陰性預測值為88.89%(56/63)，明顯高于外周血的65.75%(48/73)，差異有統計學意義(χ2=10.059，P=0.002)。結論 與外周血IGRA相比，胸腔積液IGRA可大幅提高對老年結核性胸膜炎的敏感度和特異度、陽性預測值和陰性預測值，明顯提高對老年結核性胸膜炎的診斷水平。

干擾素γ； 酶聯免疫斑點檢測； 結核，胸膜； 老年人； 胸腔積液； 敏感性與特異性

結核性胸膜炎(pleural effusion,PE)是最為常見的一種胸膜炎癥性疾病，是胸膜對結核分枝桿菌的高強度變態反應的結果，可在不同年齡段發病[1]。隨著我國人口的老齡化，老年結核性胸膜炎患者也呈逐漸增高的趨勢。老年患者代償能力差，一旦誤診或漏診，往往致病情危重，造成較高的死亡率[2]。這就需要一種微創甚至是無創、快速而又準確的診斷老年結核性胸膜炎的方法。γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)以其對檢查結核分枝桿菌感染獨有的敏感度和特異度被廣泛應用于臨床檢測中[2]，目前主要用于外周血的檢測。由于結核分枝桿菌感染所引起的機體保護性免疫反應使大量釋放γ-干擾素的淋巴細胞趨化、聚集至感染部位，因此胸腔積液的γ-干擾素釋放試驗的檢測結果可能比外周血的更準確[3]。本研究對河北省胸科醫院結核內科收住入院的疑似結核性胸膜炎的老年患者同時進行胸腔積液和外周血的IGRA，比較胸腔積液和外周血的IGRA對老年結核性胸膜炎的診斷效能。

資料與方法

一、一般資料

選取河北省胸科醫院結核內科2013年1月至2015年7月疑似為結核性胸膜炎的133例老年住院患者作為研究對象。對所有患者同時進行胸腔積液和外周血的IGRA，根據患者結核分枝桿菌的抗酸染色、培養、組織病理學檢查，以及結合臨床癥狀與體征、影像學檢查、彩色超聲檢查、臨床藥物治療效果，將患者分為：確診結核性胸膜炎組(簡稱“確診組”)，共計13例(9.77%)，年齡65～76歲，平均年齡(68.6±2.4)歲，其中男10例(76.92%)，女3例(23.08%)；臨床診斷結核性胸膜炎組(簡稱“臨床診斷組”)，共計63例(47.37%)，年齡66～78歲，平均年齡(69.3±3.6)歲，其中男53例(84.13%)，女10例(15.87%)；非結核性胸膜炎組，共計57例(42.86%)，包括炎性胸膜炎8例(14.03%)，惡性胸膜炎37例(64.91%)，風濕免疫性胸膜炎6例(10.53%)，原因不明6例(10.53%)，年齡65～83歲，平均年齡(69.4±4.2)歲，其中男46例(80.70%)，女11例(19.30%)。

1.研究對象入選標準：(1)年齡≥65歲；(2)既往無結核病病史，無糖尿病及風濕免疫病病史，無其他肺部疾病史，無HIV感染，無妊娠，無嚴重肝腎功能衰竭病史，近期(3個月內)未應用免疫抑制劑及增強劑；(3)胸腔彩色超聲檢查顯示胸腔積液；(4)抗結核藥物治療4周之內；(5)簽署患者知情同意書。

2.分組標準：(1)確診組：胸腔積液結核分枝桿菌培養陽性，或抗酸染色陽性，或胸膜活檢病理顯示干酪樣壞死的肉芽腫性改變；(2)臨床診斷組：有發熱、乏力、納差、盜汗、消瘦等典型的結核全身中毒癥狀，結核菌素皮膚試驗強陽性(硬結平均直徑≥15 mm或出現水皰、壞死及淋巴管炎)和(或)血清結核抗體陽性，實驗室檢查(常規、生化)符合結核性滲出液特點[白細胞數增高，以淋巴細胞和單核細胞為主；胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)>45 U/L，胸腔積液ADA/血清ADA>1]，抗結核藥物治療(1個月)有效；(3)非結核性胸膜炎組：實驗室及病理檢查結果均不支持結核性胸膜炎的診斷，可明確診斷為其他疾病，且治療原發病有效。

二、方法

1.主要試劑和儀器：(1)無血清培養基：RPMI(PPA laboratory Gmbh,Roswell Park Memorial Institute)-1640，GIBCO AIM-VTM(Invitrogen公司)；單個核細胞(peripheral blood mononuckear cells，PBMCs)分離液：LymphoprepTM(Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway)；無水乙醇(分析純)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)：1× DPBS PH 7.4(美國GIBCOTM公司,catalogue number 14040-091)；T-SPOT.TB(結核感染T細胞斑點試驗)試劑盒(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)；結核菌素純蛋白衍生物(北京祥瑞制藥有限公司,purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD)。(2)二級生物安全柜(美國Thermo Scientific公司),ELISPOT分析儀(德國ADI公司)：37 ℃，90%濕度，5%CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；4 ℃冰箱BCD-257SL(青島海爾公司)；超大容量低溫離心機(美國Thermo Scientific公司)；臺式振蕩器Vortex-Geniez(上海易擴儀器有限公司)；電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；新型全自動恒溫鼓風干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；移液器(美國Thermo Scientific公司)；肝素鋰真空采血管(美國BD公司,CPT，4 ml)；流式標本檢測管(美國BD公司)；細胞計數板(美國HYCOR 生物醫學公司)。

2．T-SPOT.TB檢測：采用單盲的方法，用一次性胸穿包為患者行胸腔穿刺術，采集患者胸腔積液50 ml(肝素抗凝)，同時用肝素真空采血管收集外周血5 ml，并由研究人員在6 h內分別完成二者的T-SPOT.TB檢測。T-SPOT.TB檢測以GIBCO AIM-VTM細胞培養基作為空白對照，植物血凝素(PHA)作為陽性對照，分別以結核分枝桿菌特異性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)]作為刺激原。密度梯度離心(density gradient centrifugation)分離胸腔積液 (第1次為18 ℃，1800×g，離心30 min；處理后第2次為600×g，離心7 min，棄去上清液；處理后第3次為350×g，離心7 min，棄去上清液，將沉淀懸浮于0.7 ml AIM-V培養液之中),在預先包被抗IFN-γ單抗的微孔板上，分別加入抗原和胸腔積液或外周血中單個核細胞(2.5 ×109/L)， 將微孔板置于37 ℃，90%濕度，5%CO2培養箱中孵育 18～20 h，加入二抗和顯色底物，顯色6～8 min。將微孔板置于通風、避光、干燥處過夜，應用酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)分析儀計數斑點，每一個斑點代表一個分泌IFN-γ特異性T細胞。目視法判定標準：陽性對照孔內斑點數≥20個視為試驗有效；陰性對照孔內斑點數≤5個，A孔內斑點數或B孔內斑點數-陰性對照孔斑點數≥6個，認定結果為陽性；若陰性對照孔內斑點數≥6個，A孔內斑點數或B孔內斑點數≥陰性對照孔內斑點數×2，認定結果為陽性；若A孔內斑點數或B孔內斑點數的數量<20，且陽性對照孔內斑點數≥20個，認定結果為陰性。

3. 統計學處理：數據資料的整理錄入與分析均用SPSS 18.0軟件進行。兩組間率的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

胸腔積液IGRA的敏感度、特異度均明顯高于外周血，差異均有統計學意義(χ2=12.826，P<0.001；χ2=7.015，P=0.016)；胸腔積液IGRA的陽性預測值、陰性預測值均明顯高于外周血，差異均有統計學意義(χ2=8.380，P<0.001；χ2=10.059，P=0.002)(表1)。

討 論

伴隨我國進入老齡化社會，老年肺結核發病患者逐年增加，導致老年結核性胸膜炎患者不斷增多。目前，確診結核性胸膜炎需要胸腔積液涂片發現抗酸桿菌或者結核分枝桿菌液體培養陽性，亦或胸膜活檢病理結果有干酪樣壞死的肉芽腫性組織；但前者陽性檢出率極低，僅有1.7%～24.5%[4]，后者在采集樣本時又存在一定的風險，故實際臨床診斷結核性胸膜炎主要依靠疾病史、典型的臨床癥狀與體征、胸部X線攝影、胸腔積液的實驗室檢查，以及經驗性藥物治療后的效果評估等進行綜合診斷。與其他人群相比，老年人器官功能衰退、多并發各種慢性疾病、免疫機能低下，故老年人罹患結核病時癥狀多不典型，且發病后病程長，血性胸腔積液較多見，導致結核病的診斷和鑒別診斷較困難，往往造成病情診治的延誤，出現高死亡率[5-6]。因此，臨床工作中迫切需要一種新型的、微創甚至是無創的、快速而又準確的檢測技術，以提高老年結核性胸膜炎的診斷準確性。

IGRA是近年來結核病診斷技術的重大突破。大量實驗數據表明，外周血IGRA對結核感染的診斷有較高的敏感度和特異度，但其在不同部位結核病的診斷敏感度不一致，且在結核病高流行地區其特異度也表現不佳，不能區分活動性結核病和潛伏性結核感染，使其臨床應用受限[7]。由于結核性胸膜炎的發生是結核分枝桿菌及其特異性抗原與CD4+T細胞為主的特異性T細胞相互作用的過程，胸腔積液中的各種細胞因子，如IFN-γ、白細胞介素(IL)-2、IL-6等濃度水平均明顯高于外周血，局部病變呈現隔室化特點[8]，所以相對于外周血而言，其內的抗原特異性T細胞數量可能受結核潛伏感染影響較小。文獻報道，結核性胸膜炎患者胸腔積液中效應T細胞數量與外周血比較可增高10～15倍[9]，提示在結核性胸腔積液中有足夠的效應T細胞，這就使IGRA用于在結核病高負擔國家中的結核性胸膜炎的診斷變成可能。目前，胸腔積液行T-SPOT.TB結果判定標準還沒有明確的臨界值(cut-off值)，還是按照外周血的標準來判斷，希望本研究能對T-SPOT.TB在外周血以外的應用提供依據。

表1 胸腔積液和外周血的IGRA診斷結核性胸膜炎的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值比較

注 敏感度=陽性病例數/總數×100%；特異度=陰性病例數/總數×100%；陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%；陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%。表中括號內數值分子為上述公式中的分子例數，分母為上述公式中的分母例數

本研究顯示在老年結核性胸膜炎患者中，胸腔積液IGRA的敏感度為90.79%(69/76)、特異度為98.25%(56/57)，明顯高于外周血的67.11%(51/76)和84.21%(48/57)，差異均有統計學意義(χ2=12.826，P<0.001；χ2=7.015，P=0.016)。其原因可能是抗原特異性T細胞向胸膜病變部位聚集，從而使外周血的抗原特異性T細胞數量減少。提示胸腔積液進行IGRA檢測結果可以在一定程度上用于診斷老年結核性胸膜炎。

再者，本研究顯示，胸腔積液進行IGRA檢測結果的陽性預測值為98.57%(69/70)、陰性預測值為88.89%(56/63)，高于外周血的85.00%(51/60)和65.75%(48/73)，差異均有統計學意義(χ2=8.380，P<0.001；χ2=10.059，P=0.002)，可見胸腔積液進行IGRA檢測結果能很好地幫助診斷老年結核性胸膜炎，并能為臨床醫生排除老年結核性胸膜炎提供有力依據。

本研究局限之處為僅有133例患者，確診組患者僅13例，導致敏感度、特異度等數據科學參考意義有限，需日后開展大樣本研究進一步證實。

綜上所述，與外周血IGRA相比，胸腔積液IGRA可大幅提高對老年結核性胸膜炎診斷的敏感度和特異度、陽性預測值和陰性預測值，可明顯提高老年結核性胸膜炎的診斷水平。

[1] 唐神結,高文.臨床結核病學.北京:人民衛生出版社,2011：366.

[2] 史玲莉.免疫學方法診斷結核病的研究進展.河北醫科大學學報，2013,34(11):1475-1480.

[3] 吳雪瓊,梁艷,王國治.γ-干擾素釋放試驗臨床應用的價值、問題與展望.中國防癆雜志,2015,37(7):722-727.

[4] Menzies D,Pai M,Comstock G.Meta-analysis:new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection:areas of uncertainty and recommendations for research.Ann Intern Med,2007,146(5):340-354.

[5] 陳敏,賴天文,陳衡華,等.結核性胸膜炎內科胸腔鏡下表現及其診斷價值．臨床肺科雜志,2013,18(6):1064-1065.

[6] 王洋.老年結核性胸膜炎臨床及胸腔鏡下表現分析.中國傷殘醫學,2015,23(20):95-96.

[7] 中華醫學會結核病學分會 《中華結核和呼吸雜志》編輯委員會.γ-干擾素釋放試驗在中國應用的建議. 中華結核和呼吸雜志,2014,37(10):744-747.

[8] 劉菲,張霞,杜鳳嬌，等.γ-干擾素釋放試驗檢測胸腔積液對診斷結核性胸膜炎的初步探討.中華結核和呼吸雜志,2014,37(5):323-327.

[9] Pai M,Zwerling A,Menzies D.Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update.Ann Intern Med,2008,149(3):177-184.

(本文編輯：孟莉 范永德)

Diagnostic value of pleural effusion detected with IGRA in the elderly with tuberculous pleurisy

FUHong-yi,ZHANGZhi-hua,LIUNing,CHIYue-peng,LIUHui,ZHANGQin-feng,SONGTao.

DepartmentofTuberculosisMedicine，HebeiChestHospital，Shijiazhuang050041，China

SONGTao,Email：115305048@qq.com

Objective To evaluate the value of pleural effusion detected with interferon-gamma release assay (IGRA) on diagnosis in the elderly with tuberculous pleurisy. Methods One hundred and thirty-three cases with suspected tuberculous pleurisy admitted in Hei Bei Chest Hospital were enrolled during Jan. 2013 to Jul. 2015. IGRA was tested for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and pleural effusion (PE).All patients were divided into definite tuberculous pleurisy (confirmed group), probable tuberculous pleurisy (clinical diagnostic group) and non-tuberculous pleurisy group according to the composite reference standard (CRS). The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of IGRA detected for PBMC and PE were compared, respectively. Results There were 13 (9.77%) cases with tuberculous pleurisy, 63 (47.37%) cases with probable tuberculous pleurisy and 57 (42.86%) cases with non-tuberculous pleurisy. The sensitivity (90.79%, 69/76) of IGRA for PE was higher than that (67.11%, 51/76) for PBMC with significant difference statistically (χ2=12.826，P<0.001). The specificity (98.25%, 56/57) of IGRA for PE was higher than that (84.21%, 48/57) for PBMC with significant difference statistically (χ2=7.015，P=0.016). The PPV (98.57%,69/70) and NPV (88.89%,56/63) for PE were higher than those (85.00%,51/60 and 65.75%,48/73) for PBMC with significant difference statistically (χ2=8.380，P<0.001 andχ2=10.059，P=0.002). Conclusion Compared with the result of IGRA for PBMC, IGRA for PE can improve significantly the sensitivity, specificity, PPV and NPV and then improve significantly diagnostic level in the elderly with tuberculous pleurisy.

Interferon-gamma； Enzyme-linked immunospot assay； Tuberculous，pleura； Aged； Pleural effusion； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.006

河北省2013年醫學科學研究重點課題計劃(20130440)

050041石家莊，河北省胸科醫院結核內科(付洪義、劉寧、池躍鵬、劉會、張勤鳳、宋韜)，醫務處(章志華)

宋韜，Email：115305048@qq.com

2016-02-14)