半乳糖凝集素-1對結核分枝桿菌感染巨噬細胞的調節作用及其臨床價值

劉海鵬 王鵬 楊華 鄭瑞娟 陳建霞

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半乳糖凝集素-1對結核分枝桿菌感染巨噬細胞的調節作用及其臨床價值

劉海鵬 王鵬 楊華 鄭瑞娟 陳建霞

目的 分析半乳糖凝集素-1(galectin-1，Gal-1)對結核分枝桿菌(MTB)感染巨噬細胞的調節作用，并探討其血清含量與結核病的臨床相關性。方法 選取2014年6—12月于同濟大學附屬上海市肺科醫院門診就診的活動性結核病患者40例作為病例組；選取同時期結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)陽性潛伏感染者20例作為觀察組；參照觀察組患者的年齡和性別構成，按照1∶1的比例，選擇同期體檢TST陰性健康者20名作為對照組。研究對象各采集外周血5 ml，采用ELISA檢測其血清Gal-1含量；分別采用蛋白質免疫印跡(Western blot)和ELISA檢測MTB感染人單核巨噬細胞(THP-1)后，Gal-1的表達及分泌情況；應用流式細胞術檢測外源性Gal-1(設置添加10、50 ng/ml的Gal-1組和空白對照組)對人單核巨噬細胞(THP-1)吞噬表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的MTB(MTB-GFP)的影響；應用胞內存活實驗檢測外源性Gal-1對巨噬細胞清除MTB能力的作用。結果 血清Gal-1含量病例組為(28.30±1.17) ng/ml，高于對照組的(21.28±1.74) ng/ml和觀察組的(22.06±1.25) ng/ml，差異有統計學意義(F=5.50，P=0.006)。MTB感染THP-1細胞2 h后，Gal-1表達量增加。感染復數(multiplicity of infection，MOI)值為1和5時，細胞培養液上清液中Gal-1含量分別為(391.27±34.45) pg/ml和(751.54±148.93) pg/ml。添加10、50 ng/ml Gal-1組與空白對照組MTB-GFP陽性THP-1細胞的比率分別為(6.77±0.58) %、(6.93±0.62) %和(7.64±0.74) %，三組比較差異無統計學意義(F=1.53，P=0.291)；MTB-GFP陽性THP-1細胞的平均熒光強度分別為321.67±5.03、318.00±13.89、342.67±13.65，三組比較差異無統計學意義(F=3.94，P=0.081)。感染24 h后，添加10 ng/ml和50 ng/ml Gal-1組胞內克隆形成單位數[M(Q1～Q3)]分別為3250 (2825～6225)、3250 (1850～4950)，與空白對照組[9250(8525～111 550)]比較，差異有統計學意義(U=0.00，P=0.029；U=0.00，P=0.028)；感染72 h后，分別為19 500(17 500～21 500)、12 000(11 250～15 750)，與空白對照組[38 500(31 750～44 500)]比較，差異有統計學意義(U=0.00，P=0.029；U=0.00，P=0.029)。結論 活動性結核病患者血清中Gal-1表達水平異常升高，胞外Gal-1可增強巨噬細胞對MTB的殺傷功能。因此，Gal-1具有一定的結核病輔助診斷價值，并可能通過影響巨噬細胞功能參與結核病發病過程。

結核； 分枝桿菌，結核； 半乳糖凝集素1； 巨噬細胞

肺結核是由結核分枝桿菌(MTB)感染肺部引起的慢性傳染性疾病。固有免疫系統是機體抵抗外來病原體侵襲的第一道防線，模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別并結合病原體的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)后，激活固有免疫應答反應，進而抵御病原體感染。半乳糖凝集素-1(galectin-1，Gal-1)可作為模式識別受體參與病原體識別，在機體抵抗病原微生物感染過程中發揮重要作用[1-5]，然而其在MTB感染過程中的作用未見報道。為此，本研究就Gal-1對MTB感染巨噬細胞的調節作用及其血清含量與結核病的臨床相關性進行了探討。

對象和方法

一、 對象選擇

1.對象：選取2014年6—12月于同濟大學附屬上海市肺科醫院門診就診的活動性結核病患者40例作為病例組，包括男20例(50%)，女20例(50%)；平均年齡(31.90±6.18)歲。選取同時期結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)陽性潛伏感染者20例作為觀察組，男10例(50%)，女10例(50%)；平均年齡(31.15±5.89)歲。參照觀察組患者的年齡和性別構成，按照1∶1的比例，選擇同期于本院體檢TST陰性健康對照者20名作為對照組，包括男10例(50%)，女10例(50%)，平均年齡(30.30±5.09)歲。

病例組和觀察組患者于確診當日促凝管采集外周血5 ml，對照組于體檢當天采集外周血5 ml。外周血樣本應用促凝管促凝后靜置15 min，3000×g離心10 min，收集上清，用于檢測Gal-1含量。本研究經同濟大學附屬上海市肺科醫院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

2.活動性結核病患者納入標準：(1)參照中華醫學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》[6]；(2)具有咯痰、咯血、發熱等臨床癥狀；(3)痰標本抗酸染色陽性、MTB培養陽性；(4)結合胸部X線攝片檢查確診為肺結核；(5)未經抗結核治療的初治結核病患者；(6)排除并發HIV感染、糖尿病、風濕病等疾病及妊娠者。

3.TST陽性潛伏感染者納入標準：(1)有活動性結核病患者接觸史；(2)無咯血、咯痰、低熱盜汗等臨床癥狀；(3)痰標本抗酸染色陰性、MTB培養陰性；(4)胸部X線攝片檢查正常；(5)TST陽性。

4.對照組納入標準：(1)接受健康體檢；(2)身體健康，肝腎功能各項指標均正常；(3)無慢性阻塞性肺疾病、慢性支氣管炎等慢性氣道疾病；(4)TST陰性。

二、儀器和試劑

流式細胞儀(BD Accuri C6)；Gal-1 ELISA檢測試劑盒(DGAL10，美國R&D公司)；重組Gal-1(1152-GA/CF，美國R&D公司)；Gal-1抗體(英國Abcam公司)；β-肌動蛋白抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的抗兔IgG(均來自Cell Signaling Technology，美國)；RPMI 1640 細胞培養液(美國Gibco公司)。

三、方法

1.人單核巨噬細胞(THP-1)的培養及分化：THP-1細胞經50 ng/ml佛波酯(phorbol-12-myristate 13-acetate，PMA)分化24 h后，更換新鮮RPMI 1640完全培養基，繼續培養2 d后用于后續MTB感染實驗。

2.Gal-1含量檢測：應用ELISA方法進行檢測。將THP-1細胞接種于96孔板，經PMA分化后，按感染復數(multiplicity of infection，MOI)值1和5感染MTB，24 h后收集培養上清液，直接用于后續測定。血清按照1∶10稀釋后測定。具體測定按照試劑盒說明書進行。每次測定分別設置陰性、陽性及空白對照，每個樣本設置2個復孔，取其均值作為測定值。繪制以吸光度值(A值)為橫坐標、標準品蛋白濃度為縱坐標的標準曲線，代入待測樣品的A值求出濃度。

3.巨噬細胞內Gal-1表達檢測：應用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測。將THP-1細胞接種于6孔板，經PMA分化后，按MOI值5感染MTB不同時間后，應用細胞裂解液收集細胞。細胞裂解液經12 000×g離心15 min，收集上清，加入4×蛋白質上樣緩沖液，95 ℃煮樣8 min。蛋白質樣品經分離膠分離，Western blot轉印至膜上，經脫脂牛奶封閉后，4 ℃孵育一抗過夜。其中Gal-1抗體1∶2000稀釋，β-肌動蛋白抗體1∶1000稀釋。洗滌、室溫孵育二抗(1∶1000)1 h、顯影、攝片。

4.巨噬細胞吞噬作用檢測：應用流式細胞儀檢測巨噬細胞對表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的MTB(MTB-GFP)的吞噬作用。將THP-1細胞接種于24孔板并經PMA分化。為同步化細胞吞噬過程，將分化的THP-1細胞置于冰上預孵育10 min，按MOI值5加入MTB-GFP，4 ℃ 1000×g離心10 min，分別添加不同濃度的Gal-1(分別為10、50 ng/ml)，并設置空白對照組，37 ℃ 孵育1 h，洗滌去除胞外菌，收集細胞后應用流式細胞儀檢測MTB-GFP陽性細胞比例及平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

5.胞內存活試驗：將THP-1接種于24孔板并經PMA分化，按MOI值5感染MTB 1 h，洗滌去除胞外菌，分別添加不同濃度的Gal-1(分別為10、50 ng/ml)并設置空白對照組，并分別感染后4、24、72 h用裂解液(PBS+0.1% TritonX-100)收集細胞，按10倍梯度稀釋后培養于7H11瓊脂糖板，37 ℃孵育3周后進行克隆計數。

四、統計學分析

采用Prism v5.04軟件(美國GraphPad軟件公司)進行數據的統計分析。正態分布數據計量資料采用均數±標準差表示，各組間差異的比較采用方差分析；計數資料采用率值表示，各組間差異的比較采用卡方檢驗。MTB感染細胞內克隆形成單位(CFU)采用中位數[四分位數間距，M(Q1～Q3)]表示，各組間差異的比較采用曼-惠特尼U檢驗進行統計分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、血清Gal-1含量

血清Gal-1含量病例組為(28.30±1.17) ng/ml，對照組為(21.28±1.74) ng/ml，觀察組為(22.06±1.25) ng/ml，三組比較差異有統計學意義(F=5.50，P=0.006)。進一步的組內兩兩比較顯示：病例組Gal-1含量高于對照組及觀察組，差異有統計學意義(P值分別為0.006和0.004)；對照組和觀察組比較，差異無統計學意義(P=0.718)。

二、MTB感染誘導巨噬細胞表達和分泌Gal-1

Western blot檢測發現，人單核巨噬細胞THP-1表達Gal-1，MTB感染2 h后，細胞內Gal-1表達量明顯增加(圖1)。ELISA檢測發現，MTB感染THP-1細胞24 h后，Gal-1分泌到細胞培養液上清液中，當MOI=1和5時，細胞培養液上清液中Gal-1表達量分別為(391.27±34.45) pg/ml和(751.54±148.93) pg/ml。

圖1 MTB感染誘導人單核巨噬細胞THP-1表達Gal-1情況

三、外源添加Gal-1對巨噬細胞吞噬MTB的影響

細胞培養基中添加不同濃度的重組Gal-1蛋白，流式細胞儀檢測MTB-GFP陽性THP-1細胞的比率及平均熒光強度。不添加重組Gal-1蛋白、添加10 ng/ml和50 ng/ml重組Gal-1蛋白，MTB-GFP陽性THP-1細胞的比率分別為(6.77±0.58) %、(6.93±0.62) %和(7.64±0.74) %，三組比較差異無統計學意義(F=1.53，P=0.291)。MTB-GFP陽性THP-1細胞的平均熒光強度分別為321.67±5.03、318.00±13.89、342.67±13.65，三組比較差異無統計學意義(F=3.94，P=0.081)。

四、外源添加Gal-1對MTB細胞內存活的影響

感染4 h后，Gal-1添加組與空白對照組之間MTB胞內存活差異無統計學意義。而感染24 h和72 h后，添加Gal-1(10 ng/ml)組和Gal-1(50 ng/ml)組與未處理組之間差異均有統計學意義(表1)。因此，外源添加Gal-1可明顯抑制MTB在THP-1內的增殖，提示胞外Gal-1可促進巨噬細胞清除MTB。

討 論

凝集素是一種能與細胞表面特殊糖蛋白、糖脂的寡糖結構結合的天然蛋白。動物凝集素按分子結構可分為C型凝集素、S型凝集素、P型凝集素、I型凝集素和正五聚蛋白。Gal為S型凝集素，可特異性識別β-半乳糖苷鍵，是固有免疫中重要的模式識別受體。它通過結合病毒、細菌、真菌和原生動物表面的寡糖，參與識別微生物，有效調節機體固有免疫及適應性免疫[7]。

Gal-1是最早發現的Gal家族分子，其相對分子質量為14.5×103。人類Gal-1分子由定位于染色體22q13.1的單基因編碼。Gal-1是典型的胞漿蛋白，但在細胞表面、細胞外基質和細胞核內也有表達。

Gal-1與固有免疫關系密切。Gal-1可通過調節炎性細胞遷移，抑制中性粒細胞的外滲[8]。Gal-1可以通過調節免疫球蛋白G的Fc段受體Ⅰ(FcγRI)和Ⅱ型主要組織相容性復合體(MHCⅡ)分子的表達來調節巨噬細胞的吞噬作用與抗原提呈功能，也可以通過胞外信號調節蛋白激酶1/2 (ERK1/2)依賴的信號通路調節巨噬細胞的活性[9]。Gal-1還可抑制寄生蟲感染后巨噬細胞產生白細胞介素-12(IL-12)，促進IL-10的產生，抑制免疫反應[10]。

已有報道顯示，在不同病原體感染過程中，Gal-1發揮多樣性作用。在流感病毒感染時，Gal-1可以和流感病毒結合，降低病毒對宿主細胞的侵入[5]。相反，在HIV病毒感染時，Gal-1可穩定病毒與宿主巨噬細胞的吸附，從而增強HIV對宿主巨噬細胞的感染[11]。

Gal-1在MTB感染過程中發揮的作用尚不清楚。本研究檢測了活動性結核病患者、結核潛伏感染者和健康對照者血清中Gal-1的含量，結果顯示，活動性結核病患者血清Gal-1含量高于健康對照者和潛伏感染者，潛伏感染組與健康對照組無明顯差異，提示Gal-1可能參與結核病發病過程。

隨后體外實驗研究發現，MTB感染巨噬細胞后，Gal-1的胞內表達及及胞外含量均明顯增高。這一結果提示，在MTB感染過程中，巨噬細胞是Gal-1的來源細胞之一，且其表達水平受MTB感染調控。MTB感染能上調Gal-1的表達，這與Gal-1在寄生蟲及病毒感染中的研究結果相似[12-14]，提示Gal-1參與調控感染過程中MTB和宿主巨噬細胞的相互作用。

MTB感染巨噬細胞后，Gal-1可分泌到胞外，且活動性結核病患者血清Gal-1量明顯升高。為進一步探討胞外Gal-1對MTB感染巨噬細胞的調節作用，本研究采用添加外源重組Gal-1蛋白的方法，了解Gal-1對巨噬細胞的吞噬及殺菌功能影響。添加外源Gal-1不影響MTB-GFP陽性THP-1細胞的比率及平均熒光強度，提示胞外Gal-1不影響巨噬細胞吞噬MTB的功能。然而，添加外源Gal-1后， MTB在THP-1內的存活被明顯抑制，提示胞外Gal-1可增強巨噬細胞對MTB感染的清除能力。巨噬細胞識別MTB后可通過多種機制抑制MTB增殖。已有報道顯示，Gal-1可促進肝細胞線粒體自噬[15]，而自噬可促進巨噬細胞清除MTB[16]。因此，胞外Gal-1是否通過促進自噬進而增強巨噬細胞對MTB的清除，值得進一步研究。

表1 外源添加半乳糖凝集素-1后MTB感染各時間點細胞內克隆形成單位(CFU)情況

注 表中括號外數值為“中位數(M)”，括號內數值為“第25百分位數(Q1)～第75百分位數(Q3)”；a：空白對照組與添加10 ng/ml組比較；b：空白對照組與添加50 ng/ml組比較

血清Gal-1表達水平在活動性結核病患者中異常升高，而在潛伏性感染組與健康對照組間相比無明顯差異，這不僅提示Gal-1可能參與結核病發病過程，而且提示其具有輔助診斷結核病的價值。后續可進一步擴大樣本量，以分析Gal-1是否可作為一種生物標志物用于活動性結核病患者的輔助診斷。另一方面，Gal-1具體通過何種機制增強巨噬細胞對MTB的清除能力也有待進一步研究。

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(本文編輯：李敬文)

Regulation and clinical value of galectin-1 on macrophages infected withMycobacteriumtuberculosis

LIUHai-peng,WANGPeng,YANGHua,ZHENGRui-juan,CHENJian-xia.

ClinicalTranslationalResearchCenter,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China

LIUHai-peng,Email：haipengliu2013@163.com

Objective To analyze the regulatory role of galectin-1 (Gal-1) in the process of macrophages infected withMycobacteriumtuberculosis(MTB) and to evaluate the correlation of its serum abundance with pulmonary tuberculosis. Methods From Shanghai Pulmonary Hospital affiliated to Tongji University between June 2014 and December 2014, 40 outpatients with active pulmonary tuberculosis were enrolled as patient group, 20 latent infection individuals with positive tuberculin skin test (TST) were in experimental group, and 20 healthy individuals were selected as control group; 5 ml peripheral blood were collected from each person and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to test Gal-1 in serum. The expression and secretion of Gal-1 after THP-1 infected with MTB were detected by Western blot and ELISA. Furthermore, the effects of exogenous Gal-1 (divided into Gal-1-treated group (10 ng/ml and 50 ng/ml) and untreated group) on the uptake of MTB stably transfected with green fluorescent protein (MTB-GFP) in THP-1 and the clearance of MTB in macrophages were detected by flow cytometry and intracellular survival test, respectively. Results The abundance of Gal-1 in serum was (28.30±1.17) ng/ml in patient group, which was higher than those of experimental group ((21.28±1.74) ng/ml) and control group ((22.06±1.25) ng/ml), and the difference was statistically significant (F=5.50,P=0.006). The expression of Gal-1 increased 2 hours after THP-1 being infected with MTB. Gal-1 in supernatant of cell culture medium were (391.27±34.45) pg/ml and (751.54±148.93) pg/ml when multiplicity of infection (MOI) at 1 and 5, respectively. In Gal-1-treated group (10 and 50 ng/ml) and untreated group, the percentages of THP-1 cells with MTB-GFP positive were (6.77±0.58) %, (6.93±0.62) % and (7.64±0.74) %, respectively, differences among these groups were not statistically significant (F=1.53,P=0.291), and neither was the mean fluorescent intensity (MFI) (F=3.94,P=0.081), which were 321.67±5.03, 318.00±13.89 and 342.67±13.65, respectively. The colony-forming unit (CFU,M(Q1-Q3)) 24 hours post-infection of Gal-1-treated group (10 ng/ml: 3250 (2825-6225), 50 ng/ml: 3250 (1850-4950)) were statistically significant from that of untreated group (9250 (8525-111 550)) (U=0.00,P=0.029;U=0.00,P=0.028), as well as the CFU 72 hours post-infection (the CFU were 38 500 (31 750-44 500), 19 500 (17 500-21 500) and 12 000 (11 250-15 750) in untreated and Gal-1-treated (10 and 50 ng/ml) groups, respectively (U=0.00,P=0.029;U=0.00,P=0.029)). Conclusion Gal-1 abberantly increases in serum of active TB patients, and extracellular Gal-1 enhances the killing activity of macrophages against MTB. Therefore, Gal-1 could serve as a potential biomarker for the diagnosis of TB. It may be involved in the pathogenesis of TB by modulating the function of macrophages.

Tuberculosis；Mycobacteriumtuberculosis； Galectin 1; Macrophages

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.06.011

國家自然科學基金(81200003、81370108)；上海市浦江人才計劃(16PJ408600)

200433同濟大學附屬上海市肺科醫院臨床醫學轉化中心(劉海鵬、陳建霞)，結核病臨床中心(王鵬)；上海市結核病(肺)重點實驗室(劉海鵬、楊華、鄭瑞娟、陳建霞)

劉海鵬，Email：haipengliu2013@163.com

2016-02-29)