miR—140與膝關節骨性關節炎嚴重程度的相關性

鄧黃河　陳志偉

【摘要】 目的：探析miR-140與膝關節骨性關節炎嚴重程度的相關性。方法：選擇本科收治的膝關節骨性關節炎患者60例為骨性關節炎組（OA組），按LawrenceX線診斷標準，Ⅰ～Ⅳ級患者各15例。同時選取同期非骨性關節炎患者30例為對照組（主要為外傷患者）。應用實時熒光定量（PCR）檢測上述兩組患者膝關節液中miR-140的含量。比較兩組及不同等級患者的miR-140表達水平。結果：OA組miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.01）；miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論：miR-140表達水平與膝關節骨性關節炎的嚴重程度呈負相關。

【關鍵詞】 臨床觀察； 膝關節骨性關節炎； miR-140

【Abstract】 Objective：To study the correlation of miR-140 with the severity of knee osteoarthritis.Method：60 patients with knee osteoarthritis were selected as the OA group.According to Lawrence X-ray diagnosis standard，there were 15 cases from level Ⅰ to level Ⅳ respectively.30 cases without OA were selected as the control group at the same time（they were mainly trauma patients）.Through real-time fluorescence quantification，the content of miR-140 in the two groups was detected.The expression levels of miR-140 in the two groups and patients of different degrees were compared.Result：The expression level of miR-140 in the OA group was significantly lower than that in the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.The expression level of miR-140 was reduced according with the increasing of the severity of knee osteoarthritis，the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The expression level of miR-140 is negatively correlated with the severity of knee osteoarthritis..

【Key words】 Clinical observation； Knee osteoarthritis； miR-140

First-authors address：The Peoples Hospital of Xuwen County，Xuwen 524100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.07.001

骨性關節炎（OA）是一種慢性關節病，典型特征為骨質增生，關節軟骨破壞、變性等，多見于老年患者[1]。隨著我國人口老齡化的加劇，OA的發病率出現逐年上升的趨勢。該病發病率隨年齡的增長而增加，特別是55歲之后OA發病率明顯增加。OA的發病確切機理目前仍不十分清楚。近年來，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關節炎的發病中起著關鍵作用。已有研究證明，對miR-140的編碼基因定向敲除，小鼠可發生與年齡相關的膝關節骨性關節炎樣改變，如關節軟骨的纖維化、缺失蛋白多糖等[2]。為深入探究人OA及miR-140的相關性的機制，且初步分析下游靶基因的生物信息，筆者對不同分級OA患者的膝關節液進行實時熒光定量PCR檢測miR-140表達水平，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本科收治的膝關節骨性關節炎患者60例為關節炎組（OA組），按LawrenceX線診斷標準[3]：Ⅰ～Ⅳ級患者各15例。Ⅰ級患者中男

9例，女6例，年齡27～75歲，平均（41.3±4.5）歲；

Ⅱ級患者中男8例，女7例，年齡27～75歲，平均（41.2±4.4）歲；Ⅲ級患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.4）歲；Ⅳ級患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.3）歲。同時選取同期非骨性關節炎患者30例為對照組（主要為外傷患者），其中男20例，女10例，年齡27～75歲，平均（41.5±4.2）歲，各組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）標本收集及保存：關節液分離，即采用無酶、無菌的15 mL離心管采集3～4 mL符合實驗的膝關節液，室溫環境下離心5 min，

3000 r/min，小心吸取上清液，在1.5 mL規格的EP管內分裝，-80 ℃置存。（2）提取總RNA：進行TRhol一步法提取，主要為裂解、分層、沉淀RNA、洗滌RNA、溶解RNA等步驟。（3）CDNA反轉錄：采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptionit和TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中特異性的莖-環狀反轉錄引物，進行反轉錄反應，反應在Applied Biosystems 2700熱循環儀上進行，配置反應液的所有操作均在冰上進行。反應體系見表1。反應條件：16 ℃ 0.5 h，42 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min。選擇總RNA標本：OD260/280值為1.6～2.1。總RNA反應量為100 ng/次。（4）實時熒光定量PCR反應：應用上述TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中的PCR引物探針混合液進行PCR擴增及熒光檢測。在美國Applied Biosystems公司StepOneTM熒光定量PCR儀上進行反應。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，后兩步共循環50次。PCR產物電泳：應用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，60 V，40 min。生物信息分析：進行Targetscan分析預測miR-140下游靶基因。

1.3 統計學處理 本研究所得數據采用SPSS 11.5進行統計學處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗或秩和檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

OA組的miR-140表達水平為（0.8±0.5），對照組的miR-140表達水平為（2.7±1.2），OA組的miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（t=11.32，P<0.01）；OA嚴重程度Ⅰ級miR-140表達水平為（2.3±0.9），Ⅱ級miR-140表達水平為（1.8±0.7），Ⅲ級miR-140表達水平為（1.5±0.6），Ⅳ級miR-140表達水平為（0.8±0.4），miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統計學意義（F=5.90，P<0.01）。預測has-miR-140-5P的靶基因，結果有251種靶基因，與OA相關的靶基因有轉化生長因子βⅠ型受體、骨形態發生蛋白2，見圖1。

3 討論

膝關節骨性關節炎的整個疾病過程不僅影響到關節軟骨，還涉及整個關節，包括軟骨下骨、韌帶、關節囊、滑膜及關節周圍肌肉。膝關節骨性關節炎主要見于老年人，OA導致的痛苦和殘疾嚴重損害了患者的生活質量，并成為最嚴重的社會經濟負擔之一。膝關節骨性關節炎的病因可分為原發性和繼發性兩種；原發性骨性關節炎又稱特發性骨性關節炎，多見于體力勞動者、血壓高者及女性、超過50歲、體型肥胖者；而繼發性膝關節骨性關節炎又稱創傷性關節炎，常繼發于關節畸形、關節損傷、關節炎癥或其他傷病。目前，大多數研究認為可能和患者的遺傳易感性、肥胖、骨質疏松、外傷等因素有關[4]。有研究顯示，不同種族之間OA的發病率存在一定的差異，例如髖關節骨性關節炎在高加索人種中較為多見，在我國及其他有色人種中較為少見[5]。同時OA存在明顯的家族聚集性，這樣的結果也說明其發生與遺傳存在一定的相關性；肥胖患者OA的發病率顯著上升，提示超重可能是OA發病的誘因[6]；骨質疏松者OA的發生率顯著增高，可能與軟骨下骨小梁變薄、變僵硬時，其承受壓力的耐受性就減少有關；創傷造成局部骨質破壞、缺血等，造成骨營養不良，炎癥細胞浸潤等因素可能導致OA的發生明顯增加。OA的發病確切機理目前仍不十分清楚[7]。近年來，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關節炎的發病中起著關鍵作用[8-9]。

本研究探析miR-140與膝關節骨性關節炎的嚴重程度的相關性，結果顯示OA組的miR-140表達水平顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.01）；miR-140表達水平隨OA嚴重程度增加而降低，比較差異有統計學意義（P<0.01），膝關節骨性關節炎嚴重程度與miR-140表達水平呈負相關，與Miyaki等[10]的研究結果大體一致，膝關節骨性關節炎的病變中心是軟骨損傷；疾病的第一征象為膠原纖維支架的分離，破損軟骨承受應力的能力降低，導致軟骨下骨承受相對較低的應力而發生微骨折，修復后的骨組織失去正常的彈性，引發關節軟骨的進一步損傷[11-12]；軟骨基質蛋白多糖生物合成和分解異常，軟骨細胞無法合成正常的具有長鏈結構的透明質酸和聚氨基葡萄糖，由此產生的短鏈蛋白多糖聚合物由膠原網狀結構中溢出，導致關節軟骨局部軟化、失去彈性、磨損及結構破壞；繼發反應有超氧化物自由基、膠原酶和磷脂酶的激活，進一步導致軟骨的損傷并引發關節相鄰骨骼的骨性關節炎反應[13]；miR-140micRNAs的家族成員為miR-140，某些軟骨中可表達miR-140，且可對軟骨發育進行調節，軟骨組織中特異性表達miR-140且其表達水平的改變可致病[14]。軟骨細胞中可生成成熟的miR-140，在膝關節骨性關節炎中表達水平下降可能源于膝關節骨性關節炎患者的軟骨細胞出現病理性變化，生成miR-140下降；可影響Dicer酶及Drosha酶活性的因素引發miR-140生成減少；OA患者軟骨細胞出現凋亡，引發miR-140降解；OA病情進展促進miR-140的降解因素的增加，miR-140抑制降解因素下調，miR-140表達水平減低。同時有研究發現，PDGF受體中含有負性調節作用的miR-140結合位點，miR-140基因可通過PDGF信號途徑調節PDGF受體蛋白水平，表明miR-140與軟骨的發育密切相關。miR-140在體內平衡及軟骨發育過程中發揮著重要的作用，對miR-140目標基因的敲除，建立動物實驗模型，研究結果顯示，miR-140可以對軟骨的發育進行調節，miR-140缺失引發關節軟骨的纖維化及蛋白多糖的丟失符合年齡相關的膝關節骨性關節炎樣變化[15-16]。綜上所述，miR-140表達水平與膝關節骨性關節炎的嚴重程度呈負相關。

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（收稿日期：2015-10-08） （本文編輯：王利）