基于ITS序列探討空心瓜在葫蘆科中的系統分類

江彪 劉文睿 何曉明 彭慶務 林毓娥 梁肇均 謝大森

摘 要 空心瓜是葫蘆科一年生草本植物，是葫蘆科重要的抗性資源。然而，長期以來其系統分類不清，嚴重影響空心瓜的利用。空心瓜形態學觀察結果發現，與冬瓜具有許多相似之處。隨后克隆其ITS序列，并與葫蘆科其他作物進行系統進化分析，結果發現，空心瓜與冬瓜的遺傳距離僅為0.03，位于進化樹同一個分支末端，這表明空心瓜歸屬于冬瓜屬。本研究不僅為空心瓜的系統分類提供直接的分子證據，而且為利用空心瓜拓寬冬瓜種質資源奠定重要的研究基礎。

關鍵詞 空心瓜 ；葫蘆科 ；ITS ；系統分類

中圖分類號 Q949.782 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.012

The Taxonomic Classification of Praecitrullus fistulosus in Cucurbitaceae

based on Internal Transcribed Spacer Sequences

JIANG Biao LIU Wenrui HE Xiaoming

PENG Qingwu LIN Yu'e LIANG Zhaojun XIE Dasen

（Vegetable Research Institute， GAAS / Guangdong Provincial Key Lab for New Technology

Research on Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Praecitrullus fistulosus is an annual Cucurbitaceae herb and it is an important resistant source in Cucurbitaceae. However， the systematic classification of P. fistulosus is unclear for a long time， which seriously affects its utility. Based on the morphological observation， author finds that there are many similarities between P. fistulosus and Benincasa hispida. Subsequently， this paper carries out phylogenetic analysis with other Cucurbitaceae species by clone the ITS sequence. The result showed that the genetic distance between P. fistulosus and B. hispida is only 0.03， and they locates in the same terminal branch of the phylogenetic tree. This indicates that P. fistulosus belongs to Benincasa. This study not only provides a more clear evidence for the classification of P. fistulosus， but also lays an important foundation for the utility of B. fistulosus to broaden B. hispida germplasm.

Keywords Praecitrullus fistulosus ； cucurbitaceae ； ITS ； phylogenetic classification

空心瓜[Praecitrullus fistulosus（Stocks）Pangalo，2n=2x=24]是葫蘆科一年生草本植物，起源于印度西北部，目前在印度、巴基斯坦等地廣泛種植。在印度，空心瓜被稱為“tinda”，以幼嫩果實為食用器官，也被稱為印度圓葫蘆（Indian Round Gourd）、蘋果葫蘆（Apple Gourd）和印度寶貝南瓜（Indian Baby Pumpkin）[1]。前人研究結果表明，空心瓜可能對白粉虱具有一定的抗性[2]。Levi等[3]的研究結果顯示，空心瓜在苗期抗枯萎病。因此，空心瓜可能是一個優良抗性資源，對于葫蘆科作物育種具有重要的應用潛力。

空心瓜在葫蘆科的系統分類是一個復雜的認知過程。由于空心瓜的花、種子和葉等許多形態學特征均與西瓜相似，因此，Sujatha等[1]認為空心瓜是西瓜的一個近緣野生種，并將其命名為Citrullus vulgaris var. fistulosus（tinda）。此外，基于同工酶研究結果，Navot等[4]研究發現，空心瓜與所有西瓜屬植物均不同，因此認為，空心瓜不應該歸于西瓜屬。另一方面，也有報道認為，空心瓜應歸為甜瓜屬，因為其染色體基數與甜瓜相同[5-6]。然而空心瓜與甜瓜雜交不親和，并且同工酶分析結果表明，空心瓜與西瓜、甜瓜均不相同[1]，因此空心瓜不應歸于西瓜屬或甜瓜屬。此外，Levi等[7]利用RAPD標記和ISSR標記研究空心瓜與甜瓜屬、西瓜屬的親緣關系，結果表明，空心瓜與甜瓜屬、西瓜屬間的遺傳距離較遠。

近年來，空心瓜在葫蘆科作物中的系統分類有了新的發現[3，8-9]。Schaefer等[8]利用葉綠體多基因序列對葫蘆科114個屬的25%植物進行了進化分析，結果顯示，空心瓜與冬瓜（Benincasa hispida）位于系統發育樹的同一個末枝，表明空心瓜與冬瓜具有較高的遺傳相似性。Levi等[3]利用分子標記研究空心瓜與西瓜、甜瓜、冬瓜、葫蘆、南瓜等作物的親緣關系，結果表明，空心瓜與冬瓜的親緣關系最近，同時通過花粉粒形態觀察，結果發現，空心瓜與冬瓜的花粉粒相似，均為球形或半球形，說明空心瓜很可能是冬瓜屬植物。

核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacers， ITS）是研究植物分類和親緣關系的重要工具[10-15]。因此，本研究通過克隆空心瓜的ITS序列，并與葫蘆科其他作物進行系統進化分析，從而探討空心瓜在葫蘆科作物中的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

空心瓜種子由鄭州果樹研究所王吉明研究員饋贈，種植于廣東省農業科學院蔬菜研究所白云試驗基地。同時對空心瓜的形態學性狀進行調查統計，包括葉、莖、雌雄花、果實、種子等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取剛展開的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA[16]。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質量，并將其稀釋至50 ng/μL，置于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 ITS序列擴增

ITS序列包括ITS1、5.8 S rDNA和ITS2，采用雙引物擴增。兩側引物分別為：ITSR 5′-CCTTATCATTAGAGGAAGGAG-3′[17]，ITSF 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[18]。PCR反應總體積為20 μL，包含基因組DNA 20 ng、正反向引物50 ng、dNTPs 2.5 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、10×PCR buffer和Taq DNA聚合酶1 U（TaKaRa）。PCR擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。

1.2.3 PCR產物的克隆

PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀）回收目的產物。回收產物經純化后連接于pMD19-T載體（TaKaRa），并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃培育后，進行藍白斑篩選，挑取白色單克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜。最后以菌液為模板進行PCR擴增，并將陽性克隆送往上海英俊生物技術有限公司測序。

1.2.4 序列分析

去除載體序列后，將空心瓜ITS序列與葫蘆科其他作物的ITS序列進行分析（表1）。基于已公布的序列信息[19]，確定各個ITS序列的ITS1、5.8 S和ITS2區。所有序列采用Cluster W進行多序列比對[20]，并利用Bio XM 2.6進行GC含量分析。同時，利用MEGA 5.05軟件以Kimura-2模型分析序列間的遺傳距離。進一步以秋海棠的ITS序列（AF485089）作為外根群，利用MEGA 5.05軟件以鄰接法（Neighbor-joining）和最大簡約法（Maximum parsimony）構建系統進化樹，以自展法（bootstrap）進行檢測，共循環1 000次[21]。

2 結果與分析

2.1 空心瓜的形態學觀察

空心瓜為一年生蔓生植物，莖被硬毛及長茸毛，有棱溝。葉片腎形，具深裂，邊緣有小齒。葉柄粗壯，被粗硬毛和長茸毛。雌雄同株異花，雄花具花瓣5～6枚，被長茸毛，雄蕊3個；雌花具花瓣5～6枚，近球形，被較密的長茸毛，分柱頭3個。成熟果實較小，近球形，被稀剛毛，果肉白色。種子為有棱雙邊，黑色，呈卵形，兩面平滑（圖1）。

2.2 空心瓜ITS序列克隆

以空心瓜基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得一條約720 bp的目的片段（圖2）。目的片段通過回收測序、去除18S及26S序列后，獲得總長度為614 bp的ITS1+5.8S+ITS2序列。該序列已提交到GenBank中，登錄號為KU358563。進一步將其與其他55種葫蘆科作物的ITS序列（表1）進行綜合比較。從表1中可看出，所有材料的ITS序列長度變異較大，變化范圍為591～679 bp。葫蘆科作物的5.8S rRNA較為保守，長度均為163 bp，GC含量變化范圍為57.67%～59.51%（表2）。而ITS1和ITS2變異較大，其中ITS1的長度介于179～240 bp，GC含量變化范圍為50.00%～72.28%；ITS2的長度為227～279 bp，GC含量變化范圍為54.51%～70.76%（表2）。

序列經Cluster W比對后，在259個ITS1位點中，變異位點共有196個，其中信息位點173個，占總位點的88.27%。332個ITS2位點中，變異位點有244個，其中信息位點有180個，占總位點數的54.22%。5.8S rRNA較為保守，在163個位點中，僅有16個變異位點，其中只有2個是信息位點。

2.3 葫蘆科作物ITS序列的遺傳距離及系統進化分析

利用Kimura-2模型，以MEGA 5.05軟件分析ITS序列間的遺傳距離。所有葫蘆科作物ITS之間的遺傳距離變化范圍為0.01～0.36，其中Cucumella aspera（Cucumella屬）與Oreosyce africana（Oreosyce屬）之間的遺傳距離最小，僅為0.01，而Bolbostemma paniculatum（假貝母屬）與Gomphogyne cissiformis（錐形果屬），以及Cucurbita pepo（南瓜屬）與Gomphogyne cissiformis（錐形果屬）間的遺傳距離最大，達到0.36。將空心瓜的ITS序列與所有其他作物的ITS相比較，其遺傳距離變化范圍為0.03～0.30，其中與Benincasa hispida冬瓜（冬瓜屬）的遺傳距離最近（0.03），這表明與其他葫蘆科作物相比，空心瓜與冬瓜具有更近的親緣關系。

為確定空心瓜在葫蘆科中的分類地位，以葫蘆科作物的ITS序列為材料，利用秋海棠作為外根群構建系統進化樹。所有序列經Cluster W比對后，共有775個位點，其中369個為信息位點。分別采用鄰接法和最大簡約法構建系統進化樹，2種方法均得到基本相似的結果。圖3是鄰接法構建的系統進化樹，從圖3中可看出，這56份葫蘆科作物可分為11個亞族，其中空心瓜與冬瓜均屬于Benincaseae（冬瓜）亞族，且位于同一個分支末端，遠離其他葫蘆科作物。

3 討論與結論

為了探討空心瓜在葫蘆科中的系統分類，多年來分類專家先后根據形態學及分子標記等手段開展了許多工作[1，3-8]。由于其形態特征與西瓜相似，而染色體基數與甜瓜相同，因此，人們誤認為空心瓜歸屬于西瓜屬或甜瓜屬，并期望通過雜交來拓寬西瓜或甜瓜的遺傳基礎[1，5]。近年來，Schaefer等[8]和Levi等[3]先后通過葉綠體多基因序列及分子標記和花粉粒形態學觀察等手段證實空心瓜與冬瓜具有較近的親緣關系，為空心瓜的系統分類奠定了基礎。本研究通過對空心瓜的形態學觀察，同樣發現其與冬瓜具有許多相似之處。比如空心瓜的果實形狀與小冬瓜相似、種子形狀與冬瓜的雙邊籽類似、幼果均被較多長茸毛等。

本研究進一步利用ITS序列研究空心瓜的系統分類。ITS具有進化速率快、穩定性好、測序方便等特征，是研究植物分類和親緣關系的重要工具，可解決在不同植物類群中科內的系統發育和分類問題[10-15，22]。Sharma等[22]利用ITS序列對從印度東北部收集到的蘭科植物進行系統分類研究。侯新東等[14]以ITS序列研究廬山地區12種蕁麻科植物的系統發育關系，結果發現其分類結果與傳統形態學的分類結果基本一致。

本研究首先克隆了空心瓜的ITS序列，并與葫蘆科其他作物進行系統進化分析，結果顯示空心瓜與冬瓜的遺傳距離僅為0.03，遠低于與其他葫蘆科作物的距離；系統進化分析結果表明，空心瓜與冬瓜均歸屬于Benincaseae冬瓜亞族，且位于于同一個進化樹的分支末端。綜上所述，空心瓜與冬瓜親緣關系較近，歸屬于冬瓜屬。本研究不僅為空心瓜的系統分類提供了更為直接的分子證據，而且為空心瓜優異基因的挖掘利用及冬瓜種質資源拓寬奠定了重要的研究基礎。

參考文獻

[1] Sujatha V S， Seshadri V S. Taxonomic position of round melon（Praecitrullus fistulosus）[J]. Cucurbit Genet Coop Rep， 1989， 12（1）： 86-88.

[2] Simmons A M， Levi A. Evaluation of watermelon germplasm for resistance to Bemisia[M]//Maynard D N， ed. Cucurbitacea. Alexandria： Am Soc Hortic Sci， 2002： 282-286.

[3] Levi A， Harris K R， Wechter W P， et al. DNA markers and pollen morphology reveal that Praecitrullus fistulosus is more closely related to Benincasa hispida than to Citrullus spp[J]. Genet Resour Crop Ev， 2010， 57（6）： 1 191-1 205.

[4] Navot N， Zamir D. Isozyme and seed protein phylogeny of the genus Citrullus（Cucurbitaceae）[J]. Plant Syst Evol， 1987， 156（1）： 61-67.

[5] Shimotsuma M. Cytogenetics and evolutionary studies in the genus Citrullus[J]. Seiken Ziho， 1963， 15（1）： 23-24.

[6] Kuriachan P， Beevy S S. Occurrence and chromosome number of Cucumis sativus var. hardwickii（Royle）Alef. In South India and its bearing on the origin of cultivated cucumber[J]. Euphytica， 1991， 61（2）： 131-133.

[7] Levi A， Thomas C E， Simmons A M， et al. Analysis based on RAPD and ISSR markers reveals closer similarities among Citrullus and Cucumis species than with Praecitrullus fistulosus（Stocks）Pangalo[J]. Genet Resour Crop Ev， 2005， 52（3）： 465-472.

[8] Schaefer H， Heibl C， Renner S S. Gourds afloat： a dated phylogeny reveals an Asian origin of the gourd family （Cucurbitaceae）and numerous oversea dispersal events[J]. P Roy Soc B， 2009， 276（5）： 843-851.

[9] 王吉明，馬雙武，謝漢忠，等. 空心瓜蔬菜作物簡介及其系統分類探討[J]. 中國蔬菜，2011，12（1）：16-19.

[10] Bellarosa R， Simeone M C， Papini A， et al. Utility of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of Itatlian Querces spp[J]. Mol Phylogenet Evol， 2005， 34（2）： 355-370

[11] Gurushidze M， Mashayekhi S， Blattner F R， et al. Phylogenetic relationships of wild and cultivated species of Allium section Cepa inferred by nuclear rDNA ITS sequence analysis[J]. Plant Syst Evol， 2007， 269（3）： 259-269.

[12] Zhao Y， Tsang C C， Xiao M， et al. Intra-genomic internal transcribed spacer region sequence heterogeneity and molecular diagnosis in clinical microbiology[J]. Int J Mol Sci， 2015， 16（10）： 25 067-25 079.

[13] Yang C F， Yang L T， Li Y R， et al. Sequence characteristics and phylogenetic implications of the nrDNA internal transcribed spacers（ITS）in protospecies and landraces of sugarcane（Saccharum officinarum L.）[J]. Sugar Tech， 2016， 18（1）： 8-15.

[14] 侯新東，尹 帥，盛桂蓮，等. 基于ITS序列探討10種蕁麻科植物的系統發育關系[J]. 生物技術通報，2013，8（1）：68-73.

[15] 秦雙雙，李海濤，汪周勇，等. 絞股藍屬植物親緣關系初步分析[J]. 中國中藥雜志，2015，40（9）：1 681-1 687.

[16] 謝大森，何曉明，彭慶務，等. 冬瓜DNA提取方法的研究[J]. 中國蔬菜，2010，2（1）：38-41.

[17] Stanford A M， Harden R， Parks C R. Phylogeny and biogeography of Juglans（Juglandaceae）based on matK and ITS sequence data[J]. Am J Bot， 2000， 87（5）： 872-882.

[18] White T J， Burns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M， Gelfand D， Sninsky J， White T， eds. PCR protocols： a guide to methods and application. San Diego： Academic Press， 1990： 315-322.

[19] Jobst J， King K， Hemleben V. Molecular evolution of the internal transcribed spacers（ITS1 and ITS2）and phylogenetic relationships among the species of the family Cucurbitaceae[J]. Mol Phylogenet Evol， 1998， 9（1）： 204-219.

[20] Thompson J D， Higgins D C， Gibson T J. CLUSTA W： improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting， population-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Res， 1994， 22（12）： 4 673-4 680.

[21] Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol， 2011， 28（10）： 2 731-2 739.

[22] Sharma S K， Dkhar J， Kumaria S， et al. Assessment of phylogenetic inter-relationships in the genus Cymbidium（Orchidaceae）based on internal transcribed spacer region of rDNA[J]. Gene， 2012， 495（1）： 10-15.