譜技術(shù)在臨床常見呼吸道病原菌檢測和鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展

倪麗麗　陳晉

質(zhì)譜（mass spectrometry）技術(shù)是一種測量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，可用來分析同位素、元素成分及有機物構(gòu)造等。質(zhì)譜儀最早的臨床應(yīng)用主要在于檢測一些生物標(biāo)記物以幫助診斷癌癥和遺傳疾病等。20 世紀(jì)80年代，日本島津公司的田中耕一發(fā)明了基質(zhì)輔助激光解析電離（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）技術(shù)，使得質(zhì)譜能夠檢測生物大分子[1，2]，該發(fā)明在2002年榮獲諾貝爾獎。質(zhì)譜技術(shù)的誕生和發(fā)展奠定了用蛋白質(zhì)指紋圖譜鑒定微生物的基礎(chǔ)，通過檢測未知微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜并與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中特征性譜圖進(jìn)行比對，從而對待測微生物進(jìn)行快速鑒定。由于測定的圖譜中主要的分子離子峰為菌體內(nèi)高豐度，且表達(dá)穩(wěn)定、進(jìn)化保守的核糖體蛋白，因而此法不但鑒定結(jié)果精確度高，且能借助聚類剖析獲取微生物間的進(jìn)化與親緣關(guān)系。

1 鑒定原理

MALDI-TOF MS的作用機理是把微生物樣品同等量基質(zhì)溶液聯(lián)合或分別加入樣品靶盤中，溶劑揮發(fā)后產(chǎn)生共結(jié)晶；借助激光輻射結(jié)晶體，基質(zhì)吸收激光能量使樣品吸附，產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移后游離樣品分子，樣品離子于加速電場下得到動能，繼而進(jìn)行質(zhì)量評估，將離子峰與離子質(zhì)荷比設(shè)為縱橫坐標(biāo)，產(chǎn)生質(zhì)量圖譜；通過軟件分析比較，篩選并確定出特異性指紋圖譜，從而實現(xiàn)對目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定[3]。該技術(shù)具有速度快，靈敏度高，操作簡單，信息直觀，成本低廉等特點，在對病原微生物進(jìn)行快速鑒定方面具有良好的應(yīng)用前景。

2 質(zhì)譜儀在臨床常見呼吸道病原菌鑒定中的應(yīng)用

1996年，HOLLAND等[4]首次報道了細(xì)菌不經(jīng)前處理直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，可得到完整細(xì)胞的MALDI-TOF MS指紋圖譜。KRISHNAMURTHY等研究人員用質(zhì)譜順利完成了對細(xì)菌種屬水平的鑒定。在質(zhì)譜技術(shù)逐漸成熟期間，相關(guān)MALDI-TOF MS高效、精確鑒定的研究報道也逐漸變多。當(dāng)下，臨床應(yīng)用最廣的質(zhì)譜儀是MALDI BioTYPER TM（Bruker Daltonics），SARAMISTM（Shimadzu & Anagnostec）和MALDI micro MXTM（Waters Corparation）、VITRK MSTM（BIOmERIEUX）。其中，MALDI BioTYPER TM于2011年榮獲歐洲CE認(rèn)證；VITRK MSTM于2011年榮獲歐盟體外診斷認(rèn)證及美國FDA準(zhǔn)入，且在2012年8月通過SFDA批準(zhǔn)，這就意味著MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)將在臨床微生物診斷中獲得廣泛應(yīng)用。

2.1常見呼吸道細(xì)菌鑒定 大量文獻(xiàn)報道，MALDI-TOF MS對細(xì)菌鑒定到種屬水平正確率較高，報道了臨床呼吸道中的常見的銅綠假單胞菌、嗜血桿菌肺炎鏈球菌大腸埃希氏菌和葡萄球菌等重要病原菌成功鑒定的實例，體現(xiàn)了這一技術(shù)在臨床病原菌鑒定中的應(yīng)用前景。質(zhì)譜用于細(xì)菌鑒定正確率高，應(yīng)用范圍廣，且方法和配套數(shù)據(jù)庫較為成熟。

Microflex LT（BioTyper）和Vitek MS IVD（Vitek MS）兩種質(zhì)譜系統(tǒng)分別鑒定986 株臨床需鑒定到種水平的細(xì)菌，結(jié)果顯示BioTyper與Vitek MS的鑒定正確率相當(dāng)，分別為97.2%和93.2%（P=0.608）[5]，大多數(shù)用MALDI-TOF MS不能正確鑒定的都是一些相近的菌株。Blondiaux等[6]也得出類似結(jié)論。且不同質(zhì)譜系統(tǒng)對同一類型細(xì)菌的鑒定精確度也不盡一致。

Eigner 等[7]報道了對1116株臨床分離菌和108株標(biāo)準(zhǔn)菌株的回顧性分析。通過MALDI-TOF MS Bio Typer 數(shù)據(jù)庫同傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定進(jìn)行對比，得出對標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定的精確度是93.5%，臨床分離株的鑒定精確度是95.2%，對腸球菌、葡萄球菌、腸桿菌、鏈球菌、不發(fā)酵革蘭陰性桿菌的鑒定精確度依次是100%、99.5%、95.5%、93.7%和79.7%.

嗜血桿菌的鑒定一直是臨床微生物實驗室的難題，臨床實驗室鑒定主要依賴手工方法，MALDI-TOF MS的應(yīng)用使嗜血桿菌鑒定變得更加簡便且快速。BioTyper與Vitek MS對流感嗜血桿菌的鑒定精確度都是100%，但二者對副流感嗜血桿菌的鑒定都不精確，2株菌株都鑒定失敗[5]。實驗室鑒別流感嗜血桿菌、溶血性嗜血桿菌的常規(guī)方法并不可取，溶血性嗜血桿菌常被鑒定為未分型流感嗜血桿菌，應(yīng)用BioTyper 鑒定的精確度則是99.6%[7]。

在非結(jié)核分枝桿菌鑒定方面，國外學(xué)者對107株分枝桿菌臨床分離株（包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體），利用聲波降解的熱失活方法和利用玻璃珠進(jìn)行細(xì)胞裂解的方法進(jìn)行失活和提取，再利用MALDI-TOF MS方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)兩種方法在種/屬水平上成功鑒定率分別為82.2%和88.8%。周昭彥[13]等采用MALDI-TOF MS對83株非結(jié)核分枝桿菌（臨床分離非結(jié)核分枝桿菌15 株和醫(yī)院供水系統(tǒng)環(huán)境分離非結(jié)核分枝桿菌68株）進(jìn)行快速鑒定方法及其可行性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行研究，并得出結(jié)論認(rèn)為MALDI-TOF MS可快速準(zhǔn)確地鑒定臨床和環(huán)境分離的非結(jié)核分枝桿菌，在臨床實驗室常規(guī)鑒定方面有著較好的應(yīng)用前景。

2.2常見呼吸道真菌及酵母菌鑒定 MALDI-TOF MS鑒定臨床分離真菌，近幾年，廣譜抗生素應(yīng)用率逐漸提升，真菌感染占比不斷提升，因真菌感染而病死的患者數(shù)量也非常高。所以，提升真菌鑒定技術(shù)非常關(guān)鍵。MALDI-TOF MS鑒定真菌的精準(zhǔn)度高于常規(guī)鑒定法，對絲狀真菌、酵母菌的鑒定精準(zhǔn)度依次是100%、97.9%[8]。Marklein [9]等用MALDI-TOF MS 的方法了267 株臨床分離的酵母菌和類酵母真菌，247（92.5%）株得到了準(zhǔn)確的菌種鑒定結(jié)果。Tan等[10]準(zhǔn)確鑒定了952 株臨床分離株中的128 株酵母菌分離株。Bille 等[20]用MALDI-TOF MS 鑒定酵母菌和曲霉屬真菌的準(zhǔn)確率分別為98.8% （160/162）和98.4%（63/64）。

3 直接從臨床標(biāo)本中檢測微生物

應(yīng)用MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養(yǎng)標(biāo)本中的細(xì)菌和真菌可以極大地提高檢測速度。大量的研究嘗試用不同的方法來處理血標(biāo)本，由于血培養(yǎng)基各異、數(shù)據(jù)庫和分析軟件等差異都對樣本前處理的方法標(biāo)準(zhǔn)化造成了一定的困難。布魯克公司研發(fā)了血培養(yǎng)標(biāo)本的前處理試劑盒，用于陽性血培養(yǎng)標(biāo)本直接質(zhì)譜鑒定的前處理。Kok等使用MALDI SepsityperTM試劑盒對507例血培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)液直接進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測[9]，可以正確鑒定出379例，占74.8%，其中358例為單一病原菌，21例為混合感染。這些研究結(jié)果也促進(jìn)了MALDI-TOF MS應(yīng)用于其他液體培養(yǎng)細(xì)菌快速鑒定的研究。Ferreira等用MALDI-TOF MS鑒定220份細(xì)菌數(shù)>105CFU/ml的尿液標(biāo)本，得出種和屬的精確度依次是91.8%、92.7%。

4 檢測細(xì)菌耐藥性

質(zhì)譜技術(shù)檢測病原菌耐藥性：除快速鑒定外，質(zhì)譜技術(shù)也被嘗試用于檢測一些臨床常見的耐藥基因，例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等的識別，鮑曼不動桿菌相關(guān)的耐藥機制與產(chǎn)生條件等，為控制耐藥菌株播散流行及治療提供新的策略。現(xiàn)今，對細(xì)菌耐藥性的檢測主要集中在以下幾個方向：檢測降解酶對抗生素的修飾、通過對多重耐藥菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究其耐藥機制的決定因素以及對某些靶位點如核糖體甲基化位點的分析[11]。Jung 等[12]用MALDI-TOF MS 的方法快速檢測抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌。通過檢測100 例經(jīng)血培養(yǎng)得到的抗三代頭孢霉素的腸桿科細(xì)菌所表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶，并用傳統(tǒng)方法對檢測結(jié)果進(jìn)行了驗證，用MALDI-TOF MS的方法鑒定青霉素敏感株和耐藥株的敏感性和特異性均為100%。

5 在實驗室應(yīng)用的不足與展望

5.1缺陷和改進(jìn) MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室中具有較高應(yīng)用價值，但仍有缺陷。部分遺傳背景類似的菌株存在交叉鑒定，例如大腸桿菌與志賀菌；部分細(xì)菌因標(biāo)準(zhǔn)圖譜、分類不完善使鑒定精確度變低；部分菌株的鑒定得經(jīng)蛋白提取方可完成；等等。分析鑒定精確度的差異性，多因個別菌株參考圖譜不完整所致，所以持續(xù)更新參考圖譜是提升MALDI-TOF MS鑒定精確度的重點。

5.2展望 MALDI-TOF MS不但可用于微生物種屬水平鑒定，也可用于微生物分型與亞種水平鑒定。沙門菌等細(xì)菌的血清分型流程較復(fù)雜，試劑盒成本較高，且需較多人力與物力的投資。MALDI-TOF MS的應(yīng)用可讓細(xì)菌初步分型，繼而確證血清學(xué)，省時省力，也可節(jié)約資源。但此應(yīng)用挑戰(zhàn)性較高，需要辨別更多質(zhì)譜峰，樣品準(zhǔn)備流程也較嚴(yán)格，還得綜合分析圖像，操作流程嚴(yán)謹(jǐn)性更高。

MALDI-TOF MS 方法簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢是其在臨床微生物檢測領(lǐng)域具有極其廣闊的應(yīng)用前景，雖然其對一些樣本的鑒定還存在些許的局限性，相信隨著質(zhì)譜效果好，重復(fù)性高的通用試驗試驗方法的建立，以及質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫的建立和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展另外MALDI-TOF MS與其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)聯(lián)合，可以對臨床產(chǎn)酶菌株的檢測方法、基因分型及測序、蛋白質(zhì)組學(xué)方面開展更加深入的研究，MALDI-TOF MS 的方法必將成為臨床微生物鑒定的重要工具。

參考文獻(xiàn)：

[1] Karas M，Bachmann D，Bahr U，et al.Matrix assisted ultraviolet laser desorption of non-compounds [J].Int J Mass Spectrom Ion Process ，1987，78：53-68.

[2] Tanaka K，Waki H，Ido Y，et al.Protein and polymer analysis up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometey [J].Rapid Commun Mass Spectrom ，1988，2：151-153.

[3] Fenselau C，Demirev PA.Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spevtrometry [J].Mass Spectrom Rev，2011，20（4）：157-171.

[4] Garcfa P ，Allender F，Legarraga P，et al.Bacteria identification based on protein mass spectrometry ：A new insight at the microbiology of the 21 st century[J].Rev Chilena Infectol，2012，29（3）：263-272.

[5]MARTINY D，BUSSON L，WYBO I，et al.Comparison of the Microflex LT and Vitek MS systems for routine indentification of bacteria by matrix -assisted laser desorption ionization -time of flight mass spectrometry [J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1313-1325.

[6]Blondiaux N，Gaillot O，Courcol RJ.MALDJ-TOF mass spectrometry to identify clinical bacterial isolate：Evaluation in a teaching hospital in Lille [J].Pathol Biol，2010，58（1）：55-57.

[7]BRUIN J P，KOSTRZEWA M，VAN DER ENDE A，et al.Identification of Haemophilus influenza and Haemophilus haemolyticus by matri-assisted laser desorption ionization -time od flight mass spectrometry [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2014，32（2）：279-284.

[8]IRIART X，LAVERGNE R A，F(xiàn)ILLAUX J，et al.Routine identification of medical fungi by the new Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight system with a new time effective strangey [J].J Clin Microbiol，2012，50（6）：2107-2110.

[9]Kok J，Thomas LC，Olma T，et al.Identification of bacteria in blood culture broths using matrix-assisited laser desorption-ionization Sepsityper TM and time of flight mass spectrometry[J].PlaS One，2011，6（8）：e23285.

[10]Ferreira L，Sanchez-Juanes F，Gonzalez-Avila M，et al.Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol，2010，48（6）：2110-2115.

[11]Hrabak J，Chudackova E，Walkova R.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight（maldi-tof） mass spectrometry for detection of

antibiotic resistance mechanisms from research to routine diagnosis [J].Clin Microbiol Rev，2013，26（1）：103-114.

[12]Jung J S，Popp C，Sparbier K，et al.Evaluation of MALDI-TOF MS for rapid detection of beta-lactam resistance in Enterobacteriaceae derived from blood cultures [J].J Clin Microbiol，2014，52（3）：924-930.

[13]周昭彥，胡必杰，鮑容，等.MALDI-TOF 質(zhì)譜快速鑒定非結(jié)核分枝桿菌方法的建立和評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，3：610-614.

[14]HOLLAND R D，WILKES J G，RAFII F，etal.Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using martix-assited laser desorption ionization with time of flight mass spectrometry [J].Rapid Common Mass Spectrom，1996，10（10）：1227-1232.

[15] Jacquier H，Carbonnelle E，Corvec S，etal.Revisited distribution of nonefermenting Gram-negative bacilli clinical isolates[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30（12）：1579-1586.

[16] Sogawa K，Watanabe M，Sato K，tral.Use of the MALDI Bio Typer system with MALDI-TOF mass spectrometry for rapid identification of microorganisms[J].Anal Bioanal Chem，2011，400（7）：1905-1911.

[17]Eigner U，Holfelder M，Oberdorfer K，etal.Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory [J].Clin Lab，2013，55（7-8）：289-296.

[18]E Marklein G，Josten M，Klanke U，etal.Martix-assited laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates [J].Clin Microbiol ，2009，47（9）：2912-2917.

[19]Tan K E，Ellis B C，Lee R，etal.Prospective evaluation of a martix-assited laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness [J].Clin Microbiol ，2012，50（10）：3301-3308.

[20]Bille E，Dauphin B，Leto J，et al.MALDI-TOF MS Andromas strategy for thr routine identification of bacteria ，mycobacteria，yeast，Aspergillus spp，and positive blood cultures [J].Clin Microbiol Infect ，2012，18（11）：1117-1125.

編輯/成森