果樹體細胞胚胎發(fā)生影響因子研究進展

任海燕　薛曉芳　王永康　趙愛玲　隋串玲　李登科　丁國杰

摘要：從基因型、外植體、培養(yǎng)基、碳源、外源激素、添加物、培養(yǎng)條件等內(nèi)外因素幾個方面對果樹體細胞胚胎發(fā)生的影響因子研究進展進行了綜述，并探討了存在的問題和今后的研究方向，為果樹體細胞胚的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：果樹；體細胞胚胎發(fā)生；內(nèi)因；外因

文章編號：1005-345X（2016）04-0019-04 中圖分類號：S601 文獻標識碼：A

植物體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育與合子胚相似，是離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的有效途徑。自1958年，Steward等和Reinert報道了胡蘿卜體細胞胚發(fā)生的研究后，人們在大量的植物組織培養(yǎng)、單細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細胞胚的發(fā)生。目前我國涉及該研究的樹種有數(shù)10個，已有100多種植物培育出了體細胞胚，特別是在針葉樹體細胞胚發(fā)生的生理代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征以及基因表達研究等方面取得了較好成果。近年來，關(guān)于果樹體細胞胚發(fā)生的研究也越來越多，并已在蘋果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝、藍莓、香蕉、草莓、棗、桃、柿等樹種上成功獲得體細胞胚。

作為快速繁殖和制作人工種子的重要手段的植物體細胞胚發(fā)生技術(shù)，其再生植株的最初來源是單個胚性細胞，能夠克服遺傳嵌合及后代分離問題，對于進行基因工程或細胞工程育種有著重要意義。體細胞胚的發(fā)生有直接途徑和間接途徑。前者是外植體不經(jīng)過愈傷組織階段，直接誘導分化出來；后者是通過脫分化形成愈傷組織后，體細胞胚由胚性愈傷組織發(fā)育而來。體胚的發(fā)生受多種因素影響，包括基因型、外植體類型、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)條件等。本文對影響果樹體細胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)外因素進行綜述，以期為果樹基因工程和細胞工程育種提供參考。

1內(nèi)因

1.1基因型

基因型是影響果樹體細胞胚發(fā)生的主要內(nèi)因。番木瓜和獼猴桃的兩性體比雄性體更易產(chǎn)生體胚。不同荔枝品種的同類外植體誘導胚性愈傷組織的頻率不同。同一外植體的不同柑桔品種誘導胚性愈傷組織的能力也存在顯著差異。歐洲葡萄較沙地葡萄和圓葉葡萄更難產(chǎn)生胚性愈傷。王傲雪等認為，不同基因型的適宜誘導培養(yǎng)條件不同，從而導致體細胞胚發(fā)生頻率不同。體細胞胚的發(fā)生受基因的限制，胚性細胞或細胞團形成體胚的過程是基因新一輪表達的結(jié)果。

1.2外植體

選擇適宜的外植體是誘導體細胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。常見的外植體有花藥、子葉、胚軸、成熟胚、幼胚、子房、莖尖、葉片、花瓣等。郟艷虹等研究表明，草莓的花藥、花芽、葉片、葉柄、子葉、下胚軸均可誘導出體細胞胚，但誘導率存在顯著差異，以花芽誘導率最高，可達61.74%。蘋果珠心的珠孔端細胞能形成體細胞胚，而合點端卻不能。鄧正正對胡桃楸體細胞胚誘導的研究表明，只有授粉后13周的胚軸產(chǎn)生了20%的體細胞胚，而不同時期的子葉、胚根和種胚均未誘導出胚狀體。羅君琴等認為，柑桔的下胚軸誘導胚性愈傷組織能力強于子葉、幼根及上胚軸。Ruan JY等認為，幼胚的發(fā)育程度對胚性愈傷組織的誘導起決定性作用。張健等以授粉后50 d的柑桔幼胚為外植體，經(jīng)直接發(fā)生途徑誘導體細胞胚高頻發(fā)生率。但也有人認為，在幼胚的發(fā)育過程中，只有一個較短的階段具有很強的體細胞胚發(fā)生潛能。

2外因

2.1培養(yǎng)基

用于果樹體細胞胚發(fā)生常見的培養(yǎng)基有MS、B5、NN69、DKW、WPM等，其中MS為最常用的培養(yǎng)基，因其含有NH₄NO₃較高，利于果樹體細胞胚的發(fā)生。但不同的果樹種類對基本培養(yǎng)基的選擇也有物種特異性，在葡萄體細胞胚發(fā)生過程中也有使用液體培養(yǎng)基的報道。柑桔在MT固體培養(yǎng)基的愈傷組織生長速度與體細胞胚胎發(fā)生之間的比率最佳。多數(shù)學者采用MS培養(yǎng)基成功誘導出胚狀體。而McGranahan等認為DKW是核桃體細胞胚發(fā)生的首選培養(yǎng)基，WPM更適用于黑核桃。

2.2碳源

糖類不僅是體細胞胚碳源的主要來源之一，而且作為滲透劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透勢，影響體細胞胚發(fā)生的速度和生長量。Yancheva等研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖二者結(jié)合可提高無核葡萄胚性愈傷組織的誘導率。但多數(shù)果樹體細胞胚誘導中常以3%的蔗糖作為碳源。但棗的胚狀體成苗培養(yǎng)基需將蔗糖濃度提高到5%。荔枝幼胚在胚性愈傷組織分化過程中所需適宜的蔗糖濃度為5%，其誘導率可達64.2%，若蔗糖高于8%則顯著地抑制了胚性愈傷組織分化。

2.3外源激素

誘導體細胞胚的發(fā)生需要生長素和細胞分裂素配合使用，細胞分裂素與赤霉素類在體細胞胚的發(fā)生和發(fā)育過程中起協(xié)同作用。在體細胞胚發(fā)育后期，ABA作為調(diào)節(jié)胚胎晚期發(fā)育的關(guān)鍵因子起著重要的作用。只有通過調(diào)節(jié)外源激素與內(nèi)源激素的平衡，才能成功獲得體細胞胚，形成完整植株。

2.3.1胚性愈傷組織誘導階段胚性愈傷培養(yǎng)作為成功獲得體細胞胚的重要階段，是體細胞胚發(fā)生間接途徑必須經(jīng)歷的中間階段。胚性愈傷培養(yǎng)過程中外源激素添加物的重要成分是2，4-D，在番瓜、葡萄、甜櫻桃、桃、板栗、芒果等果樹體細胞胚誘導中廣泛使用。周麗儂等認為，2，4-D雖然對荔枝幼胚的胚性愈傷組織誘導起決定性作用，但阻礙體細胞胚的進一步發(fā)育。而在利用中國櫻桃對櫻桃的不定根誘導胚性愈傷組織中，2，4-D起促進作用。郝建平等則認為，棗胚在2，4-D中2.0 mg/L激素條件下形成愈傷組織再轉(zhuǎn)入ZT 1.0mg/L+2，4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，可獲的淡黃色、顆粒狀胚性愈傷組織。除了2，4-D及其與細胞分裂素的組合之外，TDZ也能成功獲得體細胞胚。但TDZ對植物體細胞胚發(fā)生的作用因植物種類而異，有的促進，有的抑制，TDZ對體細胞胚發(fā)生的作用可能與濃度與處理時間有關(guān)。

2.3.2體細胞胚的發(fā)生階段在胚性愈傷組織的增殖階段，應及時去掉或降低生長素濃度，這樣有利于提高增殖率，而且有利于體細胞胚的發(fā)生。謝玉明等將荔枝花藥培養(yǎng)胚性愈傷組織置于MS培養(yǎng)基上獲得大量的胚狀體，但后期體細胞胚成熟較慢。灰棗在激素BA0.5 mg/L和NAA 0.01 mg/L的條件下獲得大量的體細胞胚。六月鮮棗體胚發(fā)生的研究表明，添加2，4-D的培養(yǎng)基未能獲得大量胚狀體，而是在添加IAA的培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大量胚狀體。

2.3.3體細胞胚的成熟及萌發(fā)階段 一般來說，體細胞胚一旦分化出來就可以在無激素的培養(yǎng)基上成熟并發(fā)育成植株。如，柿下胚軸誘導形成的體細胞胚在無激素的培養(yǎng)基中成苗。但許多果樹的體細胞胚發(fā)育成熟與轉(zhuǎn)化需要一些特殊條件，葡萄體細胞胚不經(jīng)處理只有3%具有成熟結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)基中添加ABA可促進體細胞胚的成熟和萌發(fā)。ABA是調(diào)節(jié)胚胎晚期發(fā)育的關(guān)鍵因素，可促進胚胎發(fā)育和種子脫水成熟，抑制體細胞胚的早熟萌發(fā)。ABA在針葉樹種和龍眼、胡蘿卜、玉米、枸杞等植物體細胞胚發(fā)生過程中的作用已有較多研究。關(guān)于ABA在果樹體細胞胚發(fā)生的研究較少。Cochba J.等認為，低濃度的ABA可促進柑桔體細胞胚發(fā)育。用10gmg/L ABA能明顯增加野生櫻桃的白色體細胞胚的發(fā)生。此外，培養(yǎng)基中添加GA3可提高芒果珠心組織和草莓葉片體細胞胚的萌發(fā)。

2.4其他添加物

培養(yǎng)基中有機附加物、滲透劑的添加等因素也會影響果樹體細胞胚的發(fā)生、發(fā)育。但不同物質(zhì)的影響在培養(yǎng)不同材料時效果有較大差異。甜櫻桃胚性愈傷組織增殖過程中，添加200 mg/L的水解酪蛋白（CH）可以提高增殖效果。六月鮮棗體細胞胚萌發(fā)時添加CH100 mg/L可促進萌發(fā)成苗。此外，AgNO₃水解乳蛋白（LH）、椰乳（CM）的添加也會促進體細胞胚的發(fā)育。

2.5環(huán)境條件

合子胚的發(fā)育在生理避光條件下的子房中進行，體細胞胚的發(fā)育與合子胚相似。因此，多數(shù)研究深入開展了光照條件對體胚誘導或發(fā)育的影響。暗處理對于荔枝葉片、草莓葉片、葡萄葉片等果樹胚性愈傷組織有顯著的影響。對蘋果葉片體細胞發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，黑暗處理有利于體細胞胚的發(fā)生，光照條件下生長緩慢且多形成畸形胚。而有些研究認為在光照條件下利于體細胞胚的發(fā)生，適宜的培養(yǎng)條件在很大程度上能影響胚性愈傷組織的產(chǎn)生。

3存在問題和今后的研究方向

體細胞胚是由體細胞發(fā)育成的胚，其發(fā)生途徑是細胞全能性表達最完全的一種方式。它不僅表明植物體細胞具有全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進程。胚性愈傷組織的誘導及體細胞胚發(fā)生過程都與基因型、外植體、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、激素水平、添加物、培養(yǎng)條件等因素關(guān)系密切。目前，體細胞胚發(fā)生的研究在基因工程、種質(zhì)、人工種子、苗木快繁、雜種合子胚挽救、多倍體植株誘導、體細胞融合、轉(zhuǎn)基因植物培育等方面有著廣闊的應用前景。關(guān)于果樹的體細胞胚發(fā)生研究已取得了一定的進展，但尚存在外植體取材的篩選、胚性愈傷誘導率和轉(zhuǎn)化率低、體細胞胚發(fā)育不整齊等亟需解決的問題。盡管如此，許多工作者已深入開展體細胞胚發(fā)生、發(fā)育機制的研究，并應用基因工程以胚狀體為受體獲得核桃、黑核桃、葡萄及梅等多種轉(zhuǎn)基因果樹。今后還需深入研究果樹體細胞培養(yǎng)各個階段的關(guān)鍵影響因子和作用機理，為實現(xiàn)基因工程在果樹育種中的應用奠定基礎。