對異煙肼與丙硫異煙胺耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株檢測及相關基因突變的研究

劉銀萍 王杰 張俊仙 梁艷 李洪敏 吳雪瓊

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對異煙肼與丙硫異煙胺耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株檢測及相關基因突變的研究

劉銀萍 王杰 張俊仙 梁艷 李洪敏 吳雪瓊

目的 研究MTB對異煙肼(INH)和丙硫異煙胺(Pto)的耐藥情況，及從臨床標本中的MTB臨床分離株直接檢測katG和inhA基因型的價值。方法 回顧性調查解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所2014年8月至2015年8月住院確診，并經抗結核藥物治療有效的結核病患者，共104例。患者臨床標本經培養鑒定為MTB，然后通過絕對濃度法同時進行INH和Pto藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，并用基因芯片檢測MTBkatG和inhA基因型。結果 104例患者的MTB臨床分離株經絕對濃度法藥敏試驗檢測顯示：20例(19.2%)對INH耐藥，其中3例高度耐藥、17例低度耐藥；5例(4.8%)對Pto耐藥，其中1例高度耐藥、4例低度耐藥；INH與Pto的交叉耐藥率20.0%(4/20)。以傳統藥敏試驗為對照，20例對INH耐藥患者中，基因芯片檢測10例(50.0%)發生katG基因315位點突變，3例(15.0%)發生inhA基因-15位點突變，1例(5.0%)發生雙基因突變；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)發生katG基因315位點突變，5例(6.0%)發生inhA基因-15位點突變。基因芯片檢測katG基因315位點突變預示MTB對INH耐藥的敏感度為55.0%(11/20)，特異度為91.7%(77/84)；inhA基因-15位點突變預示MTB對INH和Pto耐藥的敏感度分別為20.0%(4/20)和60.0%(3/5)，特異度分別為94.0%(79/84)和93.9%(93/99)。結論 大多數結核病患者的MTB臨床分離株對INH和Pto耐藥水平低，對Pto的耐藥率低，katG315和inhA-15基因突變與MTB對INH耐藥密切相關，inhA-15基因突變與MTB對Pto耐藥密切相關，應用基因芯片可快速檢測臨床標本中MTB的INH和Pto耐藥基因型。

分枝桿菌，結核； 異煙肼； 丙硫異煙胺； 抗藥性，細菌； 芯片分析技術

異煙肼(isoniazide，INH)是一線抗結核藥物，是結核病標準化療方案的重要組成藥物。根據2015年世界衛生組織報告，2014年全球約有48萬例耐多藥結核病(MDR-TB)患者，而我國約有5.7萬例[1]。由此可見，制定有效的MDR-TB治療方案對于控制結核病疫情至關重要。結核分枝桿菌(MTB)對INH耐藥后，臨床上通常應用丙硫異煙胺(protionamide，Pto)來代替INH組成治療方案[2]。Pto和乙硫異煙胺(ethionamide，Eto)均是異煙酸的衍生物，兩者與INH作用相似，有一定的交叉耐藥性[3]，可通過抑制MTB分枝菌酸的合成而發揮抗結核作用[4]。目前的研究已表明MTB耐INH主要與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)和烯酰基運載蛋白還原酶的調控基因(inhA)突變有關[5]。MTB耐Eto主要是由于參與分枝菌酸合成的inhA編碼基因和啟動子區域突變所致[6]。但目前尚未見MTB對Pto耐藥與inhA相關性的研究報道。因此，本研究將探討MTB對INH與Pto的耐藥情況，并研究應用基因芯片從臨床標本中直接檢測MTBkatG基因315位和inhA基因-15位基因型的臨床價值。

資料與方法

1.一般資料：對解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所2014年8月至2015年8月住院確診，并經抗結核治療有效的結核病患者進行回顧性調查。選擇104例鑒定為MTB感染，同時具有INH、Pto傳統藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和INH耐藥基因芯片檢測結果的患者作為研究對象。研究對象中，78例留取痰標本、10例留取支氣管灌洗液、10例留取膿液、4例留取胸腔積液、2例留取病理組織。

2.分枝桿菌培養鑒定：按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[7]，應用含對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)的BACTEC 960分枝桿菌培養系統進行分枝桿菌鑒別培養，選擇PNB陰性、TCH陽性生長物經抗酸染色證實后鑒定為MTB的患者。

3.傳統分枝桿菌藥敏試驗：按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[7]采用絕對濃度法進行傳統的MTB藥敏試驗。以MTB H37Rv標準株作為質控菌株，耐藥判定標準：高、低度耐INH濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml；高、低度耐Pto濃度分別為10 μg/ml和100 μg/ml。

4.基因突變檢測：采用晶芯?MTB耐藥檢測基因芯片(購自博奧生物集團有限公司)，按照說明書提供的標準操作規程進行PCR擴增和芯片雜交。應用MTB耐藥檢測芯片判別系統進行芯片掃描和結果判讀。

5.統計學分析：采用SPSS 17.0軟件進行數據處理。計算基因芯片檢測法的敏感度和特異度；計算各藥物耐藥發生率和交叉耐藥率，交叉耐藥率=交叉耐藥菌株數/INH耐藥菌總株數×100%；同一藥物高度耐藥和低度耐藥發生率間的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1．基本情況：104例確診的結核病患者中，40例為肺結核，29例為肺結核并發結核性胸膜炎，17例為肺結核并發氣管、支氣管結核，5例為肺結核并發骨關節結核、5例為骨關節結核，3例為肺結核并發淋巴結結核，2例為肺結核并發結核性心包炎，結核性胸膜炎、淋巴結結核和腎結核各1例。男69例，女35例，平均年齡(45.1±19.5)歲。

2.耐藥情況：通過絕對濃度法同時對104例研究對象的臨床樣本進行INH和Pto藥敏試驗，結果顯示：20例(發生率為19.2%)對INH耐藥，其中3例高度耐藥(發生率為2.9%)、17例低度耐藥(發生率為16.3%)，低度耐藥的發生率明顯高于高度耐藥(χ2=10.84，P=0.000)；5例(發生率為4.8%)對Pto耐藥，其中1例(發生率為1.0%)高度耐藥、4例(3.8%)低度耐藥，低度耐藥與高度耐藥發生率的差異無統計學意義(P=0.150)；4例INH與Pto交叉耐藥，耐藥率為20.0%(4/20)，見表1。

3.基因突變情況：應用基因芯片檢測104例研究對象MTBkatG基因315位點和inhA基因-15位點突變情況，見表2。以傳統藥敏試驗為依據，20例INH耐藥患者中，基因芯片檢測10例(50.0%)發生katG基因315位點突變，3例(15.0%)發生inhA基因-15位點突變，1例(5.0%)發生雙基因突變，則基因芯片檢測katG基因315位點突變預示INH耐藥的敏感度為55.0%(11/20)，inhA基因-15位點突變預示INH耐受的敏感度為20.0%(4/20)，兩個耐藥基因檢測總的敏感度為70.0%(14/20)；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)發生katG基因315位點突變，5例(6.0%)發生inhA基因-15位點突變，則基因芯片檢測katG基因315位點突變的特異度為91.7% (77/84), 檢測inhA基因-15位突變的特異度為94.0% (79/84), 兩個耐藥基因檢測總的特異度為85.7%(72/84)。INH耐藥基因檢測與傳統藥敏試驗的一致率為82.6%(86/104)。

5例Pto耐藥患者中，基因芯片檢測只有3例發生inhA基因-15位點突變，檢測敏感度為60.0%(3/5)；99例Pto敏感患者中，基因芯片檢測6例(6.1%)發生inhA基因-15位點突變，檢測的特異度為94.0%(93/99)。PtoinhA耐藥基因檢測與傳統藥敏試驗的一致率為92.3%(96/104)。

討 論

根據2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[8]，我國結核病患者對INH的耐藥率最高(28.6%)，對Pto的耐藥率為12.9%，均高于本研究的結果(分別為23%、5%)；也高于安徽省的INH耐藥情況(20.0%)，但Pto的耐藥情況相同(12.9%)[9]。李心德[10]分析了174株MDR-TB對二線抗結核藥的耐藥情況，結果顯示，Pto的耐藥率為12.9%。本研究Pto的低耐藥率可能系患者來源不同所致，也可能是表型藥敏試驗所用的商品化培養基的Pto耐藥界限值較高，導致的假敏感。

INH是在過氧化氫酶-過氧化物酶的作用下轉化成活性型異煙酸而發揮抗結核作用的。研究已證明，MTB的katG基因突變會導致過氧化氫酶-過氧化物酶活性喪失或活性降低，使INH不能轉化為活性型而發生耐藥[4]。Seifert等[5]對2000—2013年來自49個國家的118篇關于INH耐藥基因突變的研究進行系統綜述，發現全球INH耐藥菌株64%與katG基因315位點突變相關，19%由inhA基因-15位點突變所致。由于大多數MTB耐藥發生于katG基因315位點和inhA基因-15位點，這兩個位點已成為INH耐藥基因型檢測的主要位點。本研究結果也證實了這兩個位點的耐藥基因型檢測是可行的，并且以傳統藥敏試驗結果為對照，其具有較高的敏感度、特異度和一致率。本研究發現17例患者katG基因315位點突變，其中只有1例是高度耐藥株，其余均為低度耐藥株或敏感株。這是因為該位點突變只是導致過氧化氫酶-過氧化物酶活性降低，使INH轉換為異煙酸的效率降低，臨床加大劑量繼續用藥是有效的[11]。

表1 104例研究對象異煙肼和丙硫異煙胺傳統藥敏試驗結果

表2 104例研究對象基因芯片檢測結果與傳統藥敏試驗結果的比較

Pto與Eto均為異煙酸的衍生物，因此，從原理上講，katG基因突變似乎與Pto和Eto無關。本研究中Pto耐藥株中僅見1例katG基因突變；Morlock 等[12]未發現katG基因突變與Eto耐藥相關。但Pto、Eto與INH轉化后的活性物質作用相似，可抑制MTB分枝菌酸的合成。雖然本研究檢測Pto的耐藥株較少，但以傳統藥敏試驗為對照，基因型檢測具有較高的特異度和一致率，也初步提示Pto耐藥可能與inhA基因-15位點突變密切相關。針對此結論，筆者將擴大樣本量進一步研究證實。這一結果也預示INH與Pto和Eto之間存在一定的交叉耐藥率。本研究中，inhA基因-15位點突變在INH耐藥株中所占比例較小，且主要表現為低度耐藥；傳統藥敏試驗結果顯示，INH與Pto的交叉耐藥率也只有20.0%；3例INH高度耐藥的患者Pto表現為敏感或低度耐藥。由此提示，INH耐藥尤其是無inhA基因突變患者可選擇Pto或Eto代替INH進行治療[2]。

綜上所述，本研究大多數標本中MTB對INH和Pto耐藥水平低，對Pto的耐藥率低，提示臨床上可應用Pto代替耐藥的INH用于結核病治療；katG基因315位點和inhA基因-15位點突變與INH耐藥密切相關，inhA基因-15位點突變與Pto耐藥密切相關，應用基因芯片快速檢測臨床標本中MTB的INH和Pto耐藥基因型，可指導臨床合理用藥。

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(本文編輯：李敬文)

A study on test and related genotypes of isoniazid-and-prothionamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated from clinical specimens

LIUYin-ping,WANGJie,ZHANGJun-xian,LIANGYan,LIHong-min,WUXue-qiong.

ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

Objective To investigate isoniazid (INH) and prothionamide (Pto) resistances inMycobacteriumtuberculosis(MTB), and to assess the value of direct detection ofkatGandinhAgenotypes in MTB isolated from clinical specimens. Methods A total of 104 hospitalized TB patients undergoing effective anti-MTB treatment from Institute for Tuberculosis Research, the 309th Hospital of Chinese PLA between August 2014 and August 2015 were retrospectively studied. Clinical specimens were identified as MTB by culture media containing nitrobenzoic acid (PNB) and thiophene-carboxylic acid hydrazide (TCH) and INH and Pto drug susceptibility tests were performed at the same time by absolute concentration method. The mutations of MTBkatGandinhAgenes were detected using gene chip. Results Of the 104 clinical specimens, the results of drug susceptibility tests showed that 20 cases (19.2%) were INH-resistant, in which 3 cases were with high-level resistant, and 17 cases were with low-level resistant; 5 cases (4.8%) were Pto-resistant, including 1 case with high-level and 4 cases with low-level resistance. The cross-resistant rate between INH and Pto was 20.0% (4/20). Compared to conventional drug susceptibility test, when using gene chip in the 20 TB patients with INH resistance, 10 cases (50.0%) hadkatG315 mutations, 3 cases (15.0%) hadinhA-15 mutations, and 1 case (5.0%) had the mutations atkatG315 andinhA-15. Of the 84 INH-sensitive TB patients, 7 cases (8.3%) hadkatG315 mutations, 5 cases (6.0%) hadinhA-15 mutations. The sensitivity and specificity ofkatG315 mutations detection by gene chip for INH-resistance MTB were 55.0% (11/20) and 91.7% (77/84), respectively. The sensitivities ofinhA-15 mutation for INH and Pto resistance were 20.0% (4/20) and 60.0% (3/5), respectively; and the specificities were 94.0% (79/84) and 93.9% (93/99), respectively. Conclusion Most MTB isolated from clinical specimens were at low level of INH and Pto resistance. The rate of Pto-resistant in MTB was also low. ThekatG315 andinhA-15 mutations were closely related with INH resistance, and theinhA-15 mutation was closely related with the Pto resistance. Using gene chip could rapidly detect the INH- and Pto-resistant genotypes of MTB in clinical specimens.

Mycobacteriumtuberculosis; Isoniazid; Prothionamide; Drug resistance, bacterial; Microchip analytical procedures

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.005

“十一五”國家重大傳染病專項(No.2008ZX10003-001)；軍隊醫學科技“十二五”重點項目(BWS11J050)；解放軍第三〇九醫院課題(2014MS-012)

100091 北京，解放軍第三〇九醫院 全軍結核病研究所全軍結核病防治重點實驗室 結核病診療新技術北京市重點實驗室

吳雪瓊，Email: xueqiongwu@139.com

2016-06-08)