HPLC- Q- TOF- MS分析植物涼茶中的化學成分

游飛祥，韓彥琪，龔蘇曉，張鐵軍，*，陳常青，*（.天津中醫藥大學，天津30093；.天津藥物研究院，天津30093）

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HPLC- Q- TOF- MS分析植物涼茶中的化學成分

游飛祥1，韓彥琪2，龔蘇曉2，張鐵軍2，*，陳常青2，*
（1.天津中醫藥大學，天津300193；2.天津藥物研究院，天津300193）

摘要：運用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術（HPLC-Q-TOF-MS），對植物涼茶中的化學成分進行分析鑒定。樣品經甲醇超聲提取，采用Diamonsil C18色譜柱分離，以乙腈-0.1 %甲酸/水為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源，正負離子模式進行高分辨四極桿飛行時間質譜定性分析，色譜峰獲得了良好的分離與檢測。通過二級質譜分析結合對照品數據及相關文獻，共鑒定出43個化合物，主要包括有機酸類和黃酮苷類等成分，并對其來源進行了歸屬。結果表明，HPLC-Q-TOF-MS技術能夠比較全面地檢測植物涼茶中的化學組成，所建立的方法簡單、快速、可靠，為其質量控制與功能因子研究奠定了基礎。

關鍵詞：植物涼茶；化學成分；鑒別；HPLC-Q-TOF-MS

涼茶是以中醫養生為指導，藥食同源植物為原料，研制的具有清熱解毒、生津止渴等功效的植物飲料[1]。近年來，隨著人民生活水平的提高，越來越多的人開始關注保健和養生，我國涼茶迅速崛起成為現代化茶飲，涼茶的概念范圍已經擴大，已成為一種大眾飲料。本植物涼茶是自主研制的一款健康保健飲品，由金銀花、蒲公英、決明子、菊花、香薷5種藥食同源的天然植物原料組成，具有清熱解毒、消炎抑菌、潤喉止咳等作用，由于該涼茶是采用多種植物原料配制而成，成分復雜，涵蓋了不同極性、多個種類的化合物，分析和鑒定其中的化學成分成為闡明其功能因子的關鍵。本文采用HPLC-Q-TOF-MS技術對植物涼茶進行化學成分分析和色譜峰來源歸屬研究，明確了其化學物質基礎，為植物涼茶質量控制和功能因子研究提供了有力參考。

1　材料與儀器

植物涼茶：天津藥物研究院中藥現代研究部自制；金銀花、蒲公英、決明子、菊花、香薷飲片：均購于天津市南開區協和藥店；綠原酸、木犀草苷、金絲桃苷、蘆丁、迷迭香酸標準品：均購于中國藥品生物制品檢定所，純度均大于98.0 %；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Merck公司；甲酸（色譜純）：美國Fisher公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；其他試劑均為分析純。

Dionex Summit高效液相色譜儀：美國戴安公司；micrOTOF飛行時間質譜儀：德國Bruker公司；Diamonsil C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）色譜柱：美國Welch公司；AB204-N電子天平：德國METELER公司；超聲波清洗儀：寧波新芝生物科技；R501B星海旋轉蒸發儀：無錫市星海王生化設備有限公司；PTHW恒溫加熱套：鞏義市予華儀器有限公司。

2　方法

2.1色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1 %甲酸溶液，梯度洗脫程序：0～15 min（2 %～10 % A），15 min～75 min（10 %～40 % A）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長290 nm；進樣量20 μL。

2.2質譜條件

Bruker高性能電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜儀（micrOTOF-Q II）；電噴霧離子源（ESI）；采用正、負兩種離子化模式檢測；干燥氣的體積流量6 L/min，干燥氣溫度180℃，霧化氣壓0.8 Bar。正離子模式下，毛細管電壓4 500 V，負離子模式下的毛細管電壓2 600 V，碎裂電壓200 V，掃描范圍m/z 50～1 500。

2.3對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、木犀草苷、金絲桃苷、蘆丁、迷迭香酸標準品各5 mg，用適量甲醇溶解后，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得混標溶液，于4℃冰箱中儲存，進樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.4供試品溶液的制備

涼茶供試品溶液的制備：取本品飲料75 mL，蒸干，加適量甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，超聲20 min，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液即得涼茶供試品溶液。

原料供試品溶液的制備：取配方中各原料適量，加水回流提取1 h，濾過，取各植物提取液適量，按涼茶供試品制備方法制得金銀花、蒲公英、決明子、菊花、香薷供試品溶液。

3　結果與分析

本研究采用HPLC-Q-TOF-MS在2.1和2.2條件下對涼茶及原料供試品溶液進行分析，結果如圖1、圖2所示。

圖1　植物涼茶HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of herbal tea

圖2　植物涼茶HPLC-Q-TOF -MS正離子（A）、負離子（B）模式基峰離子色譜圖（BPI）Fig.2 HPLC-Q-TOF-MS Base peak ion chromatograms（BPI）in positive ion（A）and negative ion（B）mode of herbal tea

色譜峰獲得了良好的分離與檢測。通過分析正、負模式下的一級高分辨率質譜圖，確定了全方各色譜峰的分子離子峰，得到化合物精確分子量，并由此推斷化合物的可能分子式，然后，通過進一步分析二級質譜數據，同時結合色譜保留時間、對照品信息和相關文獻[2-21]完成化合物的鑒定。利用該方法共鑒定和歸屬了涼茶中的43個化學成分，主要包括14個機酸類、13個黃酮苷類成分，以及環烯醚萜類、蒽醌類等成分12個。

3.1色譜峰的歸屬分析

首先，通過保留時間比對初步識別色譜峰的來源，再通過比較各原料和涼茶在該時間點的質譜圖進一步確認該色譜峰的歸屬。結果顯示，43個色譜峰中，有23個峰來源于金銀花（峰1～峰4、峰7～峰11、峰14～峰22、峰25～峰29、峰31）、14個峰來源于蒲公英（峰4、峰5、峰7～峰9、峰18、峰19、峰21、峰22、峰26、峰29～峰31、峰42）、8個峰來源于決明子（峰4、峰7、峰22、峰34、峰37、峰38、峰40、峰41）、22個峰來源于菊花（峰4、峰7～峰9、峰12、峰13、峰18～峰22、峰25～峰32、峰35～峰37、峰42、峰43）、11個峰來源于香薷（峰2、峰3、峰6、峰11～峰13、峰18、峰21～峰24、峰33、峰39、峰42）。由上述統計發現，盡管植物涼茶組方中各原料量相差不多，但對于涼茶的化學貢獻卻明顯不同，其中貢獻最大的是金銀花和菊花，其次依次為蒲公英、香薷、決明子，且金銀花、菊花和蒲公英存在共有峰，說明本飲料中有些化學成分是金銀花、菊花和蒲公英的共有成分。

3.2色譜峰的鑒定與結構解析

3.2.1咖啡酰奎寧酸類化合物的鑒別

咖啡酰奎寧酸類化合物是一類由奎寧酸和不同數目的咖啡酸通過酯化反應縮合而成的酚酸類化合物，分子中羧基及酚羥基易形成穩定的氧負離子，故在負離子檢測模式下質譜信息量大。色譜峰4，7，8，9的分子離子峰[M-H]-均為m/z 353，在二級質譜中多存在m/z 191 [M-H-caffeoyl]-，179 [caffeic acid-H]-，173 [M-H-caffeoyl-H2O]-和161 [caffeic acid-H-H2O]-特征離子，符合單咖啡酰基奎寧酸的裂解規律[2]，其中8號峰通過標準品比對確定為綠原酸（3-O-咖啡酰奎寧酸），另外的4、7、9號峰中，只有峰9的MS2基峰為m/z 173，結合文獻[3]，4-O-咖啡酰奎寧酸的MS2基峰為m/z 173，而5-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡酰奎寧酸的MS2基峰為m/z 191，初步判斷9號峰為4-O-咖啡酰奎寧酸；又根據文獻[4]報道，5-O-咖啡酰奎寧酸一般只能檢出m/z 191碎片離子，m/z 179、135等碎片離子極少，推測7號峰為5-O-咖啡酰奎寧酸，同時結合文獻[5-6]報道的出峰順序：1-CQA﹥5-CQA﹥3-CQA> 4-CQA，確定4、7、8、9號峰分別為1-O-咖啡酰奎寧酸，5-O-咖啡酰奎寧酸，3-O-咖啡酰奎寧酸，4-O-咖啡酰奎寧酸。

色譜峰25、26、27、28、29、31的分子離子峰[M-H]-均為m/z 515，，二級質譜碎片主要為m/z 353，以及單咖啡酰基奎寧酸的特征離子m/z 191、179、173、161、135等，故推測為二咖啡酰基奎寧酸，其中只有26和31號峰存在m/z 173碎片離子，結合文獻[7]，3，4-二咖啡酰奎寧酸和4，5-二咖啡酰奎寧酸存在m/z 173的二級碎片，同時根據Lin等[8]對6種二咖啡酰基奎寧酸類化合物的研究發現：不含1位取代的二咖啡酰基奎寧酸其出峰順序為3，4-二咖啡酰基奎寧酸（3，4-DCQA）>3，5-DCQA﹥4，5-DCQA，可以確定色譜峰26為3，4-二咖啡酰奎寧酸，色譜峰31為4，5-二咖啡酰奎寧酸。但是峰25，27，28，29具有相似的碎片信息，不易區分，參考文獻[9-10]，初步判斷色譜峰25，27，28，29分別為1，3-二咖啡酰基奎寧酸，1，4-二咖啡酰基奎寧酸，1，5-二咖啡酰基奎寧酸，3，5-二咖啡酰基奎寧酸，這一推測有待結合核磁數據或標準品比對進一步確定。

3.2.2黃酮苷類化合物的鑒別

黃酮苷類化合物極性相對較大，負離子模式下峰響應優于正離子模式，其裂解特征以苷鍵的斷裂、糖-糖鍵的斷裂和糖環的交叉環切除為主，糖鏈順次丟失糖配基最終生成苷元離子[11]。本文通過分析化合物丟失碎片離子的質量數，推測涼茶供試品中的黃酮苷類化合物主要是單糖苷和雙糖苷，其中雙糖苷糖基有：六碳糖基-六碳糖苷（162u+162u）如峰19，六碳糖基-甲基五碳糖苷（162u+146u）如蕓香糖，峰12和35；單糖苷有：六碳糖醛酸苷（176u）如峰24和39，六碳糖苷（162u）如峰20，21，22，23，30，32，37。分析發現雙糖苷在較低的裂解電壓下，二級質譜中基峰多為[M-H-162]-或[M+H-162]+，并有脫鼠李糖峰[M-H-146]-或[M+ H-146]+；在較高的裂解電壓下，再脫去一分子葡萄糖，二級質譜中基峰多為[M-H-162-162]-或[M-H-162-146]-，并且在脫糖前及脫糖后均出現一系列連續脫水的小峰，苷元碎片的質荷比多為m/z 317、301、333、315。

對黃酮苷元離子進行分析，發現涼茶中主要有4種黃酮糖苷配基，木犀草素，其特征碎片離子為m/z 287，如峰12和22；芹菜素，其特征碎片離子為m/z 271，如峰13、19、30和42；香葉木素，其特征碎片離子為m/z 301，如峰32、39和43；金合歡素，其特征碎片離子為m/z 283，如峰35和37。

以峰20和32為例，色譜峰20的分子離子峰為449[M-H]-，以其作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的287[M-H-162]-碎片離子信息，這一裂解途徑符合黃酮苷的裂解規律，碎片離子與文獻[12]報道的圣草酚-7-O-葡萄糖苷一致，因此推斷20號峰為圣草酚-7-O-葡萄糖苷；色譜峰32的分子離子峰463[M+H]+，以其作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的301，286[M+H-176]+，258[M+H-176-28]+碎片離子信息，這與文獻[2]報道的香葉木素-7-O-葡糖苷酸的裂解碎片相同，因此推斷32號峰為香葉木素-7-O-葡糖苷酸。

3.2.3環烯醚萜苷類化合物的鑒別

文獻[13-14]總結了環烯醚萜苷類化合物的質譜裂解規律：該類化合物在正離子模式下的質譜圖中，[M+Na]+峰豐度較大，糖苷鍵易斷裂生成[M+Na-Glc]+或[M+HGlc]+碎片離子，苷元易再次通過RDA裂解產生碎片[M+Na-Glc-70]+或[M+H-Glc-70]+。以峰14和16為例，色譜峰14中m/z 427為[M+Na]+峰，m/z 265為[M+Na-Glc]+峰，m/z 195為[M+Na-Glc-70]+峰，其它碎片離子有223、179、165、121，這一裂解途徑與環烯醚苷類的質譜裂解規律一致，結合文獻[15]判斷色譜峰14為secoxyloganin。同樣，色譜峰16質譜圖中碎片離子m/z 781[M+ Na]+，m/z 587 [M+Na-Glc-CH3OH]+，m/z 549 [M+Na-Glc-70]+，m/z 387[M+Na-Glc-70-Glc]+也符合上述質譜裂解規律，根據文獻[5]，確定色譜峰16為centauroside。

3.2.4蒽醌類化合物的鑒別

蒽醌類化合物分子的共軛體系結構決定了其分子較穩定，二級質譜碎片較少，碎片易歸屬，文獻[16]表明，失去母核基團中的CH3或CO但留存共軛體系是主要裂解方式。以峰34和41為例，色譜峰34分子離子峰為491 [M-H]-，主要碎片離子有m/z 476 [M-HCH3]-和m/z 461M-H-2CH3]-，與文獻[17]報道一致，故推斷色譜峰34為橙黃決明醌苷；色譜峰41分子離子峰為331[M+H]+，主要碎片離子有m/z 315[M+H-CH3]+和m/z 297[M+H-CH3-H2O]+，這與文獻[18]報道一致，故推斷色譜峰41為橙黃決明素。

植物涼茶中化學成分的HPLC-Q-TOF-MS鑒別分析結果，見表1。

表1　植物涼茶中化學成分的HPLC-Q-TOF-MS鑒別分析結果Table 1 Qualitative analysis results of chemical components in herbal tea by HPLC-Q-TOF-MS

4　結論

高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術（HPLC-Q-TOF-MS）具有高分離度、高速度、高靈敏度等特點，是一種快速區分和鑒定涼茶多組分、復雜成分的有效方法，通過HPLC可將其分離，在一級質譜中可確定其分子量，再通過二級質譜得到各化合物的不同碎片信息，結合在HPLC中其保留時間信息并與文獻或標準品對照從而確定化合物的結構。本文通過HPLC-Q-TOF-MS技術，對植物涼茶中的成分進行了全面分析，通過色譜分離、質譜鑒定共鑒別了5種藥食同源植物配方中的43個化學成分，明確了其化學物質基礎，主要為有機酸及黃酮苷類成分，并對其藥材來源進行了歸屬，為植物涼茶質量控制和功能因子研究提供了一定的理論參考。

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Analysis of Chemical Constituents in Herbal Tea Based on HPLC-Q-TOF-MS

YOU Fei-xiang1，HAN Yan-qi2，GONG Su-xiao2，ZHANG Tie-jun2，*，CHEN Chang-qing2，*
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193，China）

Abstract：To analyze and identify the chemical constituents in herbal tea by HPLC-Q-TOF-MS. The samples were extracted with methanol，separated by the Diamonsil C18 column with a gradient elution of acetonitrilewater containing 0.1 % formic acid. Positive and negative ion mode electrospray ionization and high-resolution quadrupole time of flight mass spectrometry was employed for qualitative analysis. Based on the MS/MS analysis，comparing references and relevant literature dates，forty-three compounds of herbal tea were identified，mainly including organic acids and flavonoids. Furthermore，all of the constituents were surveyed and classified according to their medicinal materials derivation. The results showed that HPLC-Q-TOF-MS could elucidate the main components in herbal tea in a more comprehensive way and the method established was simple，fast and reliable，which laid the foundation for quality control and functional components studies.

Key words：herbal tea；chemical constituents；identification；HPLC-Q-TOF-MS

收稿日期：2015-12-23

*通信作者

作者簡介：游飛祥（1991—），男（漢），碩士研究生，主要從事中藥質量和復方制劑研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.039