八聚體結(jié)合蛋白-4對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

趙　娟，田　怡，李　凡

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

八聚體結(jié)合蛋白-4對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

趙娟，田怡，李凡

[摘要]目的探討八聚體結(jié)合蛋白-4(octamer-bindingprotein-4，Oct 4)在胃癌(gastriccarcinoma)組織及其4株細(xì)胞系(MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1)中的表達(dá)，并分析其對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法收集20例胃癌手術(shù)患者的癌變組織和20例正常組織，通過Real time PCR(RT-PCR)和Western blot法檢測Oct 4在胃癌組織及其4株細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在干擾掉Oct 4后，采用MTT的方法檢測BGC-823細(xì)胞的增殖活性，通過Transwell小室法檢測BGC-832細(xì)胞的侵襲活性，利用Western blot法檢測MMP-2及MMP-9的表達(dá)。結(jié)果RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Oct 4 mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)Oct 4在BGC-832表達(dá)水平最高。下調(diào)Oct 4的表達(dá)導(dǎo)致BGC-823細(xì)胞增殖和侵襲活性被抑制，MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平均降低。結(jié)論Oct 4在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并且敲除Oct 4會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性明顯減弱，降低MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平。Oct 4在胃癌組織中的過量表達(dá)有助于胃癌的臨床診斷，同時(shí)Oct 4在胃癌的惡性腫瘤生物活性中發(fā)揮著重要作用。

[關(guān)鍵詞]八聚體結(jié)合-4；胃癌；BGC-823細(xì)胞；增殖；侵襲

胃癌是威脅人類健康常見的惡性腫瘤之一。盡管胃癌的手術(shù)、放療、化療和分子靶向等臨床治療方法較多，但療效均不滿意，患者5年生存率均較低，特別是在化療方面，目前仍無標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案。因此，隨著研究胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制的深入，尋找抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)目標(biāo)，從而開發(fā)出新一代抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的抑制劑，對胃癌的防治具有非常重要的臨床意義。八聚體結(jié)合蛋白-4(octamer-bindingprotein-4，Oct4)主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞。對維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新能力具有極其重要的作用[1-2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Oct4基因表達(dá)于膀胱癌[3]、乳腺癌[4]、胰腺癌[5]、骨和軟骨瘤[6]中，但在正常組織中不表達(dá)。也有研究報(bào)道，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染并沉默特定基因在胃癌細(xì)胞的表達(dá)，可以抑制胃癌細(xì)胞的生長[7]。因此，筆者推測Oct4可能在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中起著重要作用。本研究檢測Oct4基因在胃癌組織和不同分化程度胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并采用RNA干擾技術(shù)沉默Oct4基因的表達(dá)，以研究其表達(dá)水平對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集

收集上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院2014年10月至2015年10月20例胃癌患者手術(shù)切除的癌組織及其對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本。所有患者在手術(shù)前均未接受過局部或全身治療。所有標(biāo)本取下后立刻用液氮-80 ℃凍存。本研究經(jīng)上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，并獲得所有患者的知情同意書。

1.2細(xì)胞和主要試劑

MKN-28、SGC-7901、BGC-823分別為高、中、低分化人胃癌細(xì)胞系，GES-1為胃黏膜正常細(xì)胞。上述細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。TRIzol試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，RT-PCR試劑盒購自Fermentas，細(xì)胞蛋白R(shí)IPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Oct siRNA(human)序列及干擾轉(zhuǎn)染(siRNA)購自Qiagen公司，ECM膠、Oct3/4及GAPDH兔抗人抗體購自Sigma公司，MMP-2和MMP-9多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，侵襲性小室購自Corning公司，熒光定量PCR的引物均由Invitrogen公司提供。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞用RPMI-1640或DMEM(GIBCO-BRL)培養(yǎng)基培養(yǎng)，補(bǔ)充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100 mg/ml鏈霉素，置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)胃癌BGC-823細(xì)胞生長密度至70%～80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依據(jù)轉(zhuǎn)染類型，將BGC-823細(xì)胞分為3組：Oct4 siRNA(干擾作用的siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞)組、陰性siRNA組(不具有任何干擾作用的siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞)、對照組(未轉(zhuǎn)染任何siRNA的BGC-823細(xì)胞)。

1.3.2RT-PCR檢測從標(biāo)本中取100 mg腫瘤組織,剪碎后加入一定量TRIzol(Invitrogen)，按常規(guī)方法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(Fermentas)獲取cDNA，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行Oct4基因的RT-PCR。根據(jù)GenBank中Oct4 cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAA￣GCTG-3′，下游引物為5′-CCACATCGGCCTGTGTATATccCAG-3′，產(chǎn)物大小為140 bp。上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，產(chǎn)物大小為138 bp。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，95 ℃變性1 min，冷卻至55 ℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55 ℃開始到95 ℃，每次增加0.5 ℃，保持4 s，同時(shí)讀取吸光度，制作溶解曲線，以目的基因與GAPDH的比值進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3.3Western blot檢測當(dāng)細(xì)胞生長至接近80%匯合時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞后再收獲細(xì)胞，加入蛋白裂解液RIPA(含終濃度為1 mmol的PMSF及1%的蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min(r=3.5 cm)，取上清BCA測蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，然后用15 V轉(zhuǎn)印1 h至硝酸纖維素薄膜，轉(zhuǎn)印結(jié)束后將膜放入封閉液中37 ℃封閉2 h；加入一抗4 ℃過夜，PBST洗膜3次后，加入二抗孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光。圖像經(jīng)掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0進(jìn)行吸收度積分值分析，計(jì)算相對表達(dá)率(實(shí)驗(yàn)灰度值/內(nèi)參灰度值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4MTT檢測細(xì)胞增殖將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到%孔板中，每種細(xì)胞每天設(shè)3個(gè)副孔，每孔2 000個(gè)細(xì)胞，每孔中加0.1 ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。向第1天檢測孔中每孔加20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液上清棄去，每孔加入100 μl DMSO，搖床混勻約5 min。酶標(biāo)儀490 nm比色(PBS緩沖液調(diào)零)，連續(xù)檢測5 d，繪制腫瘤細(xì)胞生長曲線。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.5細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)上述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)中，將5×104個(gè)細(xì)胞加入上層的無血清培養(yǎng)基中；侵襲實(shí)驗(yàn)中，將1×105個(gè)細(xì)胞加入上層的無血清培養(yǎng)基中；下層小室為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后，用甲醇固定遷移或侵襲至下層的細(xì)胞并用0.1%的結(jié)晶紫染色，并用IX71倒置顯微鏡計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理RT-PCR、Western-blot均采用不同實(shí)驗(yàn)批次的標(biāo)本重復(fù)3次，RT-PCR產(chǎn)物的量及Western-blot表達(dá)量均用內(nèi)參β-actin校正，相對恢復(fù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Oct4在胃癌組織及不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

RT-PCR檢測20例胃癌組織標(biāo)本結(jié)果顯示，癌組織中Oct4的表達(dá)水平高于癌旁組織(圖1A)；4株細(xì)胞系檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Oct4在正常胃黏膜細(xì)胞膜細(xì)胞株GES-1不表達(dá)，胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中均表達(dá)，但是各細(xì)胞株的表達(dá)程度有所不同，分化程度越低的細(xì)胞系表達(dá)水平越高(圖1B)；通過Westernblot檢測上述4株細(xì)胞中Oct4的表達(dá)，胃癌細(xì)胞株均表達(dá)，但是在GES-1中未發(fā)現(xiàn)Oct4蛋白的存在(圖1C、D)。

注：GSE-1、MKN-28、SGC-7901、BGC-823為胃癌細(xì)胞株。A為RT-PCR檢測Oct4在腫瘤組織中的表達(dá)；B為RT-PCR檢測Oct4在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)；C、D為Western blot檢測Oct4在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及灰度分析。與GES-1組比較aP<0.05，bP<0.01圖1　Oct4在胃癌組織及不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2干擾Oct4表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Oct4在BCG-823胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平最高，同時(shí)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)50 mmol/L siRNA轉(zhuǎn)染效率最佳，因此在此濃度下利用該細(xì)胞作為模型進(jìn)行功能缺失性研究，RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后Oct4表達(dá)水平較對照組下降，尤其以si-Oct4-2干擾效果最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A。在此基礎(chǔ)上，采用MTT增殖實(shí)驗(yàn)觀察Oct4對細(xì)胞增殖的影響。與對照組相比，在不同觀察時(shí)間點(diǎn)24、48、72 h Oct4表達(dá)受抑制后其細(xì)胞增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2B。以上結(jié)果表明，Oct4的表達(dá)對胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用。

注：A為RT-PCR檢測BGC-823 siRNA的干擾效率；B為MTT法檢測BGC-823細(xì)胞增殖圖2　Oct4表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞增殖的影響

2.3干擾Oct4表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

與GES-1比較，BGC-823胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小室下層的細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明抑制Oct4表達(dá)引起腫瘤侵襲能力降低。見圖3。

圖3　Oct4表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞手術(shù)BGC-823侵襲及遷移能力的影響電鏡圖

2.4干擾Oct4表達(dá)對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

從圖4可以看出，Western blot結(jié)果顯示干擾后，MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),推測Oct4可能通過影響MMP-2和MMP-9的表達(dá)，調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖4　干擾Oct4表達(dá)對胃癌細(xì)胞MMP-2及MMP-9表達(dá)影響的電泳圖

3討論

腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是靠少數(shù)腫瘤干細(xì)胞不斷自我更新以及繁衍來維持和促成的。而Oct4又是自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因此，檢測Oct4在胃癌中的表達(dá)有助于理解其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。近年來，有研究結(jié)果顯示，Oct4基因在一些腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，如非生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞如胰腺癌pan-1細(xì)胞系、肝癌Mahlava細(xì)胞系、宮頸癌Hela細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系表達(dá)[2，8]。同樣在腫瘤組織中Oct4也有表達(dá)，如人乳腺痛及骨肉瘤組織[9]等。這說明Oct4基因在腫瘤的發(fā)生中有著重要促進(jìn)作用。

從本實(shí)驗(yàn)RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，20例胃癌組織標(biāo)本結(jié)果顯示癌組織中Oct4的表達(dá)水平高于癌旁組織；4株細(xì)胞系檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Oct4在正常胃黏膜細(xì)胞膜細(xì)胞株GES-1不表達(dá)，胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中均表達(dá)Oct4，但是各細(xì)胞株的表達(dá)程度有所不同，分化程度越低的細(xì)胞系表達(dá)水平越高。進(jìn)一步對Oct4基因表達(dá)量高的低分化胃癌細(xì)胞BGC-823行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染Oct4 siRNA的BCG-823細(xì)胞內(nèi)Oct4 siRNA相對表達(dá)量及Oct4蛋白表達(dá)量明顯下降。在細(xì)胞增殖和侵襲性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Oct4 siRNA后BGC-823細(xì)胞增殖能力顯著降低和細(xì)胞穿膜數(shù)量下降，表明Oct4基因表達(dá)下降導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降，降低了胃癌細(xì)胞的惡性度。

同時(shí)，本研究通過Western blot技術(shù)檢測到MMP-2及MMP-9的表達(dá)均明顯下降。不難看出，抑制Oct4的表達(dá)對MMP-2及MMP-9的表達(dá)有顯著的抑制作用。而MMP-2和MMP-9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用己經(jīng)被深入研究，尤其在結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌和腎癌等多種腫瘤中的作用己進(jìn)行了大批量的臨床驗(yàn)證[10]。Oct4以直接或間接的方式同時(shí)下調(diào)MMP-2和MMP-9，從多個(gè)層面抑制了結(jié)腸腫瘤的進(jìn)展，體現(xiàn)出了極高的效率。盡管這些調(diào)控過程仍需進(jìn)一步探索，但Oct4無疑成了胃癌形成及發(fā)展過程中基因網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中非常重要的樞紐部分。

綜上所述，Oct4在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中能高表達(dá)，敲除Oct4基因后會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性明顯減弱，同時(shí)降低MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平。Oct4在胃癌組織中的過量表達(dá)有助于胃癌的臨床診斷，有望成為早期檢測胃癌及評(píng)估患者預(yù)后的一個(gè)分子生物學(xué)指標(biāo)，乃至成為藥物治療的新靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Burdon T, Smith A, Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells[J]. Trends Cell Biol, 2002, 12(9): 432-438.

[2]Looijenga LH, Stoop H, de Leeuw HP, et al. POU5F1 (OCT3/4) identifies cells with pluripotent potential in human germ cell tumors[J]. Cancer Res, 2003, 63(9): 2244-2250.

[3]Atlasi Y, Mowla SJ, Ziaee SA, et al. OCT-4, an embryonic stem cell marker, is highly expressed in bladder cancer[J]. Int J Cancer, 2007, 120(7): 1598-1602. DOI:10.1002/ijc.22508.

[4]Ezeh UI, Turek PJ, Reijo RA, et al. Human embryonic stem cell genes OCT4, NANOG, STELLAR, and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma[J]. Cancer, 2005, 104(10): 2255-2265. DOI:10.1002/cncr.21432.

[5]Iki K, Pour PM. Expression of Oct4, a stem cell marker, in the hamster pancreatic cancer model[J]. Pancreatology, 2006, 6(4): 406-413. DOI:10.1159/000094317.

[6]Gibbs CP, Kukekov VG, Reith JD, et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2005, 7(11): 967-976.

[7]蔡世榮，王昭，陳創(chuàng)奇，等. 沉默PRL-3基因表達(dá)抑制胃癌生長研究[J]. 中華外科雜志, 2008, 46(8):618-621.

[8]Abate-Shen C. Homeobox genes and cancer: new OCTaves for an old tune[J]. Cancer Cell, 2003, 4(5): 329-330.

[9]Gibbs CP, Kukekov VG, Reith JD, et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2005, 7(11): 967-976.

[10] Park KS, Kim SJ, Kim KH, et al. Clinical characteristics of TIMP2, MMP-2, and MMP-9 gene polymorphisms in colorectal cancer[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(2): 391-397. DOI:10.1111/j.1440-1746.2010.06504.

(本文編輯：王映紅)

Effects of Octamer-bindingprotein-4 on the proliferation and invasion of gastric carcinoma cells

Zhao Juan, Tian Yi, Li Fan

(Department of Gastroenterology, Minhang District Central Hospital, Shanghai 201199, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of octamer-binding protein-4 (Oct 4) in the tissue of gastric carcinoma and 4 strains of cell line (MKN-28, SGC-7901, BGC-823 and GES-1), and to analyze the effects of the substance on the proliferation, migration and invasion of cells.Methods The canceration tissues of gastric carcinoma in 20 surgical patients and the normal tissues of 20 non-carcinoma patients were collected for the study. The expression levels of Oct 4 in the tissues of gastric carcinoma and 4 strains of cell line were detected by real time PCR and Western Blot. Following depletion of Oct 4, the proliferation activity of BGC-823 cells was detected by MTT assay, and the invasion of BGC-832 cells was detected by Transwell assay. Western Blot was further used to determine the expression levels of MMP-2 and MMP-9.ResultsReal time PCR revealed that there was a high expression level of Oct 4 mRNA in the tissue of gastric carcinoma, while low expression level was detected in the normal tissue. Western Blotting indicated that its expression level was the highest in BGC-832 cells. However, the down-regulation of Oct 4 would result in the reduction of proliferation and invasion activity, and the expression levels of MMP-2 and MMP-9 would be decreased.ConclusionThe elevated Oct 4 expression in the gastric carcinoma tissue and cells and Oct 4 gene knock-out would induce significant decrease in the proliferation of gastric carcinoma cells and cell invasion activity, and decrease the expression levels of MMP-2 and MMP-9. The over-expression of Oct 4 in the gastric carcinoma tissue would facilitate clinical diagnosis of the disorder, and it seemed that Oct 4 played an important role in the regulation of gastric carcinoma biological activity.

[Key words]Oct 4; Gastric carcinoma; BGC-823 cell; Proliferation; Invasion

(收稿日期：2015-10-19)

[中圖分類號(hào)]R735.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.02.006

[通信作者]李凡，電子信箱：syrile@126.com

·論著·

[作者單位]201199上海，上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科