長鏈非編碼核糖核酸?；撬嵘险{基因1在乳腺癌中的表達及其對細胞增殖凋亡的影響

趙筱倩，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院乳腺病科，江蘇無錫214000）

?

長鏈非編碼核糖核酸?；撬嵘险{基因1在乳腺癌中的表達及其對細胞增殖凋亡的影響

趙筱倩，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院乳腺病科，江蘇無錫214000）

摘要：目的探討長鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）?；撬嵘险{基因1（TUG1）在乳腺浸潤性導管癌（IDC）中的表達及其對乳腺癌細胞增殖及凋亡功能的影響。方法篩選2013年1月～12月該院乳腺病科行手術切除并經病理檢查證實為IDC患者的乳腺癌及對應癌旁組織40例。運用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測lncRNA-TUG1在IDC患者腫瘤及癌旁組織中的表達水平，整理分析lncRNA-TUG1表達與患者臨床病例資料間的相關性；采用lncRNA-TUG1特異性siRNA轉染人乳腺癌MCF-7細胞，采用CCK-8試驗檢測轉染siRNA后MCF-7細胞增殖能力的變化；流式細胞儀檢測轉染后MCF-7細胞凋亡變化。采用qRT-PCR、Western-blot檢測轉染后P27表達變化。結果lncRNA-TUG1在IDC組織中表達水平顯著高于對應癌旁組織（t =4.273，P<0.001），IDC組織中lncRNA-TUG1高表達與腫瘤直徑增大（P=0.033）及高TNM分期（P= 0.045）顯著相關；lncRNA-TUG1特異性siRNA轉染MCF-7細胞后可顯著抑制細胞增殖（P=0.041）并上調凋亡細胞比例（t=3.206，P=0.007）；qRT-PCR及Western-blot結果證實，沉默lncRNA-TUG1后可顯著促進P27 mRNA及蛋白表達水平（P<0.001）。結論lncRNA-TUG1在IDC組織中表達上調并與腫瘤惡性臨床病理特征有關，lncRNA-TUG1可能通過下調抑癌基因P27的表達來促進IDC生長。

關鍵詞：lncRNA-TUG1；乳腺浸潤性導管癌；增殖；凋亡；P27

乳腺癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤[1]，由于其具有發病隱匿、進展快及術后易復發的特點，已成為危害我國女性身體健康的重大公共衛生問題[2]。乳腺浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）是乳腺癌較為常見且惡性程度較高的病理類型之一[3]，對IDC細胞分子生物學特性的研究對于尋找IDC新的治療靶點及提高我國乳腺癌診治水平具有重要意義。

長鏈非編碼核醣核酸（long noncoding ribonucleic acid，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼單鏈RNA[4]。越來越多的證據表明[5]，lncRNA能夠通過多種方式調節包括腫瘤生長、轉移及血管生成在內的多種病理過程來促進惡性腫瘤的發生、發展。lncRNA的異常表達及其所發揮的生物學功能是近年來乳腺癌分子病理學的研究熱點之一。最新研究指出，長鏈非編碼核糖核酸?；撬嵘险{基因1（long noncoding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1，lncRNA-TUG1）在癌癥進展過程中具有重要的調節作用[6]，而其在乳腺癌中的臨床意義及生物學功能尚不清楚。本研究通過檢測lncRNA-TUG1的表達及對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡過程的調控作用，研究lncRNA-TUG1在乳腺癌生長中的臨床意義及作用機制，為乳腺癌的分子診斷與靶向治療提供一定的理論依據。

1　資料與方法

1.1臨床標本及主要試劑

篩選2013年1～12月于江蘇省無錫市婦幼保健院乳腺病科行手術切除并經病理檢查證實為IDC患者的乳腺癌及對應癌旁組織（距腫瘤邊緣>2 cm）40例。平均年齡（51.2±1.1）歲。所有患者術前均未行新輔助放化療。所得組織標本均保存于液氮當中。lncRNA-TUG1 siRNA及陰性對照siRNA均購自上海吉瑪生物科技有限公司，CCK-8試劑盒及Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海生工生物科技有限公司，lncRNA-TUG1引物（正向引物5'-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3'；反向引物5'-TA GCAGTTCCCCAATCCTTG-3'），P27引物（正向引物5'-GATGGACGCCAGACAAGC-3'；反向引物5'-CTC CTGCCATTCGTATCTGC-3'），β-actin引物（正向引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'）由上海生工生物科技有限公司合成，RNA提取試劑盒fast200購自上海飛捷生物科技有限公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒[PrimeScriptTMRT reagent Kit （Perfect Real Time）]及實時定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）試劑盒[SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）]均購自寶生物工程（大連）有限公司，兔抗人P27多克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國CST公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，1×DMEM液體培養基購自美國HyClone公司，人正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及ECL試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2RNA提取及熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

按fast200說明書分別提取癌、癌旁組織及MCF-10A、MCF-7細胞中總RNA，經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280者為合格樣品。取500 ng總RNA為模板，按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系，采用Random 6及Oligo-dT雙引物法逆轉錄細胞內lncRNA及mRNA。逆轉錄完成后，以2μl cDNA配制Real-time PCR體系，按Real-time PCR說明書要求擴增靶基因。

1.3細胞培養

MCF10A及MCF-7細胞均接種于含10%胎牛血清的1×DMEM培養基中，在含5%二氧化碳CO2的37℃培養箱中以飽和濕度進行培養。待細胞穩定傳代2～3代后，取對數生長期細胞進行后續試驗。

1.4細胞轉染

MCF-7細胞接種于6孔板中，接種密度以過夜培養后融合度可達50%為準。依據Lipofectamine?2000說明書，以無血清DMEM培養基按表1配制轉染體系，分別向MCF-7細胞中轉染lncRNA-TUG1 siRNA及NC siRNA。轉染6 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養基。

表1　6孔板轉染體系（每孔）

1.5CCK-8檢測

分別收集轉染24、48及72 h后的MCF-7細胞，重懸后以2 000/孔接種于96孔板中，調整細胞懸液體積為100μl/孔，培養至細胞貼壁。每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續孵育2 h，棄上清液，15 min內用酶標儀檢測450 nm波長下的光密度（optical density，OD）值。

1.6細胞凋亡檢測

MCF-7細胞轉染72 h后使用PBS溶液洗滌細胞2次，按試劑盒說明書要求，采用Binding buffer （1×）重懸細胞并調整細胞密度至2×105/ml，于檢測管中加入195μl細胞懸液后加入5μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min后，使用200μl Binding buffer（1×）洗滌細胞并以1 000 r/min離心細胞3 min，再次以190μl Binding buffer（1×）溶液重懸細胞后加入10μl Propidium Iodide，避光孵育15 min后于流式細胞儀上進行檢測。

1.7Western blot檢測

收集轉染72 h的MCF-7細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，BCA法測定總蛋白濃度。垂直電泳分離蛋白后，以1∶1 000稀釋的P27及β-actin一抗結合相應目的蛋白，以1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔二抗結合一抗，ECL法發光檢測蛋白相對表達量。

1.8統計學方法

所有數據均采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或ANOVA檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1IDC及癌旁組織中lncRNA-TUG1的表達差異

IDC組織中lncRNA-TUG1的相對表達量為（5.186±0.231），而對應癌旁組織中lncRNA-TUG1表達量僅為（1.644±0.047）。Student-t檢驗證明兩組標本間lncRNA-TUG1表達差異具有統計學意義（t=4.273，P<0.001），見圖1。

表2　lncRNA-TUG1表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系（n=40，±s）

注：?P<0.05

項目　lncRNA-TUG1相對表達量　P值年齡＜50歲　5.179±0.201　0.737 ≥50歲　5.281±0.132絕經與否已絕經　5.193±0.111　0.868未絕經　5.134±0.207腫瘤直徑＜2 cm　3.483±0.097　0.033?≥2 cm　6.959±0.114腫瘤數量1個　5.374±0.211　0.068 ≥2個　5.937±0.182組織學分級G1～G2　5.089±0.107　0.083 G3　5.313±0.132淋巴結轉移無5.043±0.037　0.057 有5.588±0.071 TNM分期無4.117±0.068　0.045?有5.883±0.120

2.2IDC組織中lncRNA-TUG1異常表達與患者臨床特征間的相關性

為探究IDC組織中lncRNA-TUG1的異常表達是否會影響IDC患者的臨床病理表現，筆者對表2所列的臨床病理特征進行二分類，并計算lncRNA-TUG1相對表達量。經統計學分析發現，IDC組織中高表達水平的lncRNA-TUG1與腫瘤直徑增大（>2 cm）及高TNM分期（III+IV期）具有一定的相關性。提示lncRNA-TUG1在乳腺癌進展過程中可能具有一定的生物學功能。

2.3沉默lncRNA-TUG1對MCF-7細胞增殖凋亡的影響

筆者通過PCR檢測證實，乳腺癌MCF-7細胞中lncRNA-TUG1的相對表達量高于人正常乳腺上皮細胞MCF-10A（P<0.001），見圖2A，其表達差異約2.31倍。然后，筆者采用瞬時轉染技術，以Lipo-fectamine?2000為媒介，將lncRNA-TUG1特異性siRNA或NC siRNA轉染入MCF-7細胞中。通過qRT-PCR檢測證實，lncRNA-TUG1特異性siRNA能敲低細胞內lncRNA-TUG1的表達水平（P<0.001），見圖2B。

圖2　siRNA沉默MCF-7細胞lncRNA-TUG1表達

圖3　沉默lncRNA-TUG1對MCF-7細胞增殖凋亡的影響

成功沉默MCF-7細胞內lncRNA-TUG1表達后，筆者首先采用CCK-8法檢測lncRNA-TUG1表達水平變化對MCF-7細胞增殖能力的影響。如圖3A所示，與NC組比較，敲低lncRNA-TUG1后可顯著抑制MCF-7細胞增殖能力（P=0.041）。如圖3B、3C所示，進一步通過流式細胞儀檢測發現沉默lncRNA-TUG1對MCF-7細胞的凋亡具有顯著的促進作用[（18.435±1.377）vs（9.833±1.024），t =3.206，P=0.007]。

2.4下調lncRNA-TUG1對MCF-7細胞中P27表達的影響

P27是一種具有細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）活性抑制作用的蛋白，能通過與細胞周期蛋白-CDK復合物結合來抑制細胞周期進展，最終抑制細胞增殖。筆者在MCF-7細胞內沉默lncRNA-TUG1表達后，通過qRT-PCR和Western-blot檢測發現，P27 mRNA及蛋白水平均較NC組出現升高（P<0.001），見圖4A、4B，提示lncRNA-TUG1可能是通過抑制P27表達而現促腫瘤細胞生長作用的。

圖4　沉默lncRNA-TUG1對MCF-7細胞P27表達的影響

3　討論

在全球，女性乳腺癌年患病人數逾百萬。目前，無論是我國[7]還是西方發達國家[8]，乳腺癌發病率均占女性惡性腫瘤發病首位。隨著分子生物學技術的進步，生物靶向治療已成為乳腺癌重要的輔助治療手段，曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名赫賽?。┘芭镣字閱慰梗∣mnitarg，商品名奧密塔克）已在乳腺癌治療上獲得巨大成功[9-10]。因而，尋找和研究有效的的乳腺癌分子治療靶點對改善廣大乳腺癌患者預后具有重要意義。

目前，越來越多的證據顯示，包括微小核糖核酸（microRNA）及lncRNA在內的多種非編碼核糖核酸（noncoding RNA，ncRNA）對細胞的生理及病理過程具有重要影響。并且，針對ncRNA在疾病中的異常表達，具有極大的藥物研發潛力，目前已有miR-122 和miR-34 2個microRNA進入了臨床研究階段[11]。lncRNA-TUG1是近年來新發現的1種lncRNA，其對于組織發育及多種良惡性疾病的發展均具有調控作用，在小鼠大腦皮層發育的多個關鍵時期均能夠檢測到lncRNA-TUG1表達的顯著上調[12]。而在惡性腫瘤中，lncRNA-TUG1的異常表達具有重要的臨床治療監測及預后評價意義，Zhang等[13]的研究表明，lncRNA-TUG1在骨肉瘤組織中的表達顯著上調且與腫瘤體積增大、術后化療抵抗及高Enneking分期顯著相關，生存分析曲線結果也證實高表達的lncRNA-TUG1預示著較短的術后無瘤生存時間和總生存時間。因而，lncRNA-TUG1表達水平的改變被認定與腫瘤進展、轉移和復發密切相關。

在本研究中，筆者首先在臨床組織標本中檢測證實，lncRNA-TUG1高表達于浸潤性乳腺導管癌組織當中。以患者不同臨床病理特征為亞組的分析表明，lncRNA-TUG1高表達與IDC患者腫瘤直徑增大及高TNM分期密切相關，本研究結果與在骨肉瘤、膀胱癌[14]及腦膠質瘤[15]中的研究結果相一致。為進一步探討lncRNA-TUG1在乳腺癌細胞中的生物學功能，筆者應用siRNA特異性敲低MCF-7細胞中lncRNA-TUG1表達，通過CCK-8試驗及流式細胞儀分析證實沉默lncRNA-TUG1能夠抑制細胞增殖并促進細胞凋亡的發生。組織學及細胞學實驗結果一致表明，lncRNA-TUG1在乳腺癌細胞生長過程中具有一定的促進作用。

位于人類染色體12p12.0～12p13.1處的P27基因，能編碼1個長度為198個氨基酸的多肽。P27能分別與Cyclin E-CDK2和Cyclin D-CDK4結合形成三元復合物而抑制CDK的活性，通過阻礙細胞周期進展而實現抗細胞增殖效應[16]。研究表明[15]，多梳蛋白抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）能通過對P27啟動子H3K27位點進行甲基化修飾而抑制P27的表達。而肝細胞癌中的lncR-NA-TUG1能夠通過與PRC2復合物中EZH2和SUZ12兩種組分的結合而將PRC2募集至抑癌因子KLF2的啟動子區域，進而促進HCC的生長和轉移[17]。綜上，筆者推測，lncRNA-TUG1的促乳腺癌細胞生長作用可能是在表觀遺傳學層面通過啟動子區域甲基化修飾作用而抑制P27的表達來實現的。為證實這一假說，筆者通過siRNA轉染技術，特異性敲低MCF-7細胞內lncRNA-TUG1的表達，通過qRT-PCR檢測及Western-blot檢測發現，沉默lncRNA-TUG1可明顯提高MCF-7細胞內P27的表達水平，初步探明了lncRNA-TUG1的作用機制。

綜上所述，lncRNA-TUG1在浸潤性乳腺導管癌組織中表達升高。lncRNA-TUG1可能通過下調P27的表達來抑制乳腺癌細胞的生長。因此，lncRNA-TUG1在乳腺癌生物靶向治療中具有一定的研發價值。

參考文獻：

[1]張磊,許培權.三陰性乳腺癌的系統治療策略[J].現代腫瘤醫學, 2015, 23(18): 2686-2690.

[2]莫文菊,丁小文,謝尚鬧,等.紫杉醇通過mTOR信號通路影響乳腺癌細胞的增殖遷移[J].中國醫師雜志, 2015, 17(7): 1005-1008.

[3]肖宇,雷玉濤,趙紅梅,等. 41例雙側原發性乳腺癌的臨床病理特征分析[J].現代腫瘤醫學, 2014, 22(12): 2859-2863.

[4]王瑩,辛彥. Hippo通路和相關長鏈非編碼RNA(LncRNA)與腫瘤關系的研究進展[J].現代腫瘤醫學, 2015, 23(21): 3190-3193.

[5] Sugihara H, Ishimoto T, Miyake K, et al. Noncoding RNA expression aberration is associated with cancer progression and is a potential biomarker in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 27824-27834.

[6]?zgür E, Mert U, Isin M, et al. Differential expression of long non-coding RNAs during genotoxic stress-induced apoptosis in HeLa and MCF-7 cells[J]. Clin Exp Med, 2013, 13(2): 119-126.

[7]鄭瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征[J].中國癌癥雜志, 2013, 23(8): 561-569.

[8] Trotter K, Schneider SM, Turner BS. Group appointments in a breast cancer survivorship clinic[J]. J Adv Pract Oncol, 2013, 4 (6): 423-431.

[9] Tolaney SM, Barry WT, Dang CT, et al. Adjuvant paclitaxel and trastuzumab for node-negative, HER2-positive breast cancer[J]. N Engl J Med, 2015, 372(2): 134-141.

[10] Suparna BW, Sherry XY,王卓路,等.貝伐單抗聯合化療的乳腺癌新輔助治療[J].中國普通外科雜志, 2013, 22(11): 1377-1378.

[11]徐艷敏,馬清華,武佳,等.腺病毒介導miR-122聯合化療藥物ADM對肝癌細胞殺傷作用的研究[J].浙江理工大學學報, 2010, 27(6): 919-923.

[12]牟麗麗,雷燦,鐘小靈,等.長非編碼RNA-Tug1在大腦皮層發育過程中的初步研究[J].中國科學:生命科學, 2015, 45(2): 156-165.

[13] Zhang Q, Geng PL, Yin P, et al. Down-regulation of long non-coding RNA TUG1 inhibits osteosarcoma cell proliferation and promotes apoptosis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14 (4): 2311-2315.

[14] Han Y, Liu Y, Gui Y, et al. Long intergenic non-coding RNA TUG1 is over expressed in urothelial carcinoma of the bladder [J]. J Surg Oncol, 2013, 107(5): 555-559.

[15] Cai H, Xue Y, Wang P, et al. The long noncoding RNA TUG1 regulates blood-tumor barrier permeability by targeting miR-144 [J]. Oncotarget, 2015, 6(23): 19759-19779.

[16]劉鏡文,魏茂富,邱小靈. P27在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達及其意義[J].中國現代醫生, 2012, 50(26): 92-93.

[17] Qiu M, Xu Y, Wang J, et al. A novel lncRNA, LUADT1, promotes lung adenocarcinoma proliferation via the epigenetic suppression of P27[J]. Cell Death Dis, 2015, 6: Doi: 10.1038/cddis. 2015.203.

（張蕾編輯）

論著

Expression of long noncoding RNA TUG1 and its role in cell proliferation and apoptosis of breast cancer

Xiao-qian Zhao, Xiao-wei Lu
(Department of Breast Diseases, Wuxi Maternal and Child Health-Care Hospital of Jiangsu Province, Wuxi, Jiangsu 214000, China)

Abstract:Objective To study the expression of long noncoding RNA TUG1 (lncRNA-TUG1) in invasive ductal carcinoma (IDC) and its role in regulating cell proliferation and apoptosis. Methods Fourty IDC and matched tumor adjacent tissues were collected between January and December in 2013. The expression of lncRNA-TUG1 tissues were detected by qRT -PCR. The relationship between lncRNA -TUG1 and clinical features was analyzed by student-t test. lncRNA-TUG1 siRNA was transfected into MCF-7 cells. CCK-8 assay and flow cytometry (FCM) were used to measure cell proliferation and apoptosis, respectively. The expression of P27 in transformed cells was detected by qRT-PCR and Western blot. Results The expression of lncRNA-TUG1 was significantly higher in IDC tissues than in tumor adjacent tissues (P < 0.001). High expression of lncRNA-TUG1 was positively associated with large tumor diameter (P = 0.033) and advanced TNM stage (P = 0.045). Knockdown of lncRNA-TUG1 significantly suppressed cell proliferation and induced apoptosis in MCF-7 cells (P < 0.05). P27 expression was upregulated when lncRNA-TUG1 was silenced (P < 0.05). Conclusions lncRNA-TUG1 is overexpressed in IDC tissues and associated with cell growth. lncRNA-TUG1 may promote IDC progression by inhibiting P27 expression.

Keywords:lncRNA-TUG1; invasive ductal carcinoma; proliferation; apoptosis; P27

[通信作者]陸肖瑋，E-mail：zhaoxiaoq1980@126.com；Tel：13815100097

收稿日期：2015-10-30

文章編號：1005-8982（2016）08-0022-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.005

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A