鈣黏蛋白E、橋粒芯糖蛋白2、磷酸化Akt和轉(zhuǎn)錄因子Snail在侵襲性前列腺癌中的作用

匡小跟，張暉輝，許韓峰，李清，曹友漢

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖南衡陽421001）

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鈣黏蛋白E、橋粒芯糖蛋白2、磷酸化Akt和轉(zhuǎn)錄因子Snail在侵襲性前列腺癌中的作用

匡小跟，張暉輝，許韓峰，李清，曹友漢

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖南衡陽421001）

摘要：目的探討鈣黏蛋白E（E-cadherin）、橋粒芯糖蛋白（2DSG2）、磷酸化Akt（pAkt）和轉(zhuǎn)錄因子Snail在前列腺癌發(fā)病進(jìn)程中的作用；闡明E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail對(duì)前列腺癌發(fā)病進(jìn)程的影響及在臨床預(yù)后中的作用。方法組織芯片法檢測(cè)E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail在前列腺癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果前列腺癌組織中E-cadherin表達(dá)明顯低于正常前列腺組織，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可觀察到pAkt表達(dá)，且在腫瘤高分化區(qū)和低分化區(qū)內(nèi)均有較高表達(dá)。E-cadherin和DSG2表達(dá)呈顯著正相關(guān)。E-cadherin和DSG2表達(dá)下降提示前列腺癌患者血清前列腺特異性抗原（PSA）濃度含量增加，Gleason評(píng)分較高及病理分期更高。結(jié)論前列腺癌低分化細(xì)胞中鈣黏蛋白表達(dá)降低，鈣黏蛋白低表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞侵襲性更強(qiáng)，轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。鈣黏蛋白在前列腺癌發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，E-cadherin和DSG2有望成為侵襲性前列腺癌的預(yù)后因子。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；預(yù)后；組織芯片；E-cadherin；DSG2；pAkt；Snail

前列腺癌診斷和治療的主要挑戰(zhàn)是預(yù)測(cè)當(dāng)前癌癥狀態(tài)能否會(huì)進(jìn)展為侵襲性癌癥[1]。到目前為止，除了血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）外[2]，還沒有確定的預(yù)后因子用于前列腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)。因此，識(shí)別和發(fā)展新的能夠有效預(yù)測(cè)前列腺癌侵襲性的預(yù)后標(biāo)志物勢(shì)在必行。

蛋白激酶B（protein kinase B，PKB或Akt）和磷酸化Akt（phosphorylated Akt，pAkt）在前列腺癌中過表達(dá)，Akt/pAkt蛋白表達(dá)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)[3-4]。盡管目前發(fā)現(xiàn)前列腺癌中鈣黏蛋白E （E-cadherin）表達(dá)缺失[5-6]，但目前尚未見關(guān)于E-cadherin表達(dá)缺失與前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)性的研究報(bào)道。此外，目前也未見關(guān)于橋粒芯糖蛋白2 （desmoglein 2，DSG2）在前列腺癌中表達(dá)情況的研究報(bào)道。以往研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路活化可通過上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail抑制前列腺癌E-cadherin轉(zhuǎn)錄。本研究檢測(cè)前列腺癌組織標(biāo)本中DSG2、活化Akt和Snail表達(dá)情況及其相關(guān)性，并分析E-cadherin及DSG2和生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性，探討E-cadherin和DSG2作為前列腺癌侵襲性有效預(yù)測(cè)因子的潛力。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

128例前列腺癌組織標(biāo)本均為2001年1月-2005年12月南華附屬第一醫(yī)院泌尿外科前列腺癌手術(shù)后樣本。用于mRNA提取的所有組織均是經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)及恥骨弓上前列腺切除術(shù)中迅速收集，然后投入已經(jīng)準(zhǔn)備好的液氮中，冷凍保存。切取組織直接用包埋劑進(jìn)行包埋，制作冷凍切片。所有病例均經(jīng)HE染色確定，并進(jìn)行Gleason評(píng)分及臨床分期。術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌。

1.2主要方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，應(yīng)用組織芯片制備儀制備芯片。首先每個(gè)組織制作1張HE切片，由病理專家在顯微鏡下將病變的典型部位進(jìn)行定位，并在切片上標(biāo)記相關(guān)區(qū)域，然后將該切片和石蠟組織塊進(jìn)行比較，依靠HE切片上標(biāo)記在石蠟組織塊同一部位也做一標(biāo)記，這樣就可以做到準(zhǔn)確定位。制備長(zhǎng)36 mm×寬26 mm×高15 mm大小的空白蠟塊，在此蠟塊26 mm× 21 mm范圍內(nèi)打孔（1.5 mm）制成12×9共108點(diǎn)陣芯片的模塊。穿刺事先標(biāo)記的目標(biāo)組織（直徑1.5 mm），準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔內(nèi)。每例標(biāo)本均編號(hào)，從空載體芯片臘塊第1排第3孔開始，依次按序操作直至將所有標(biāo)本均種植于空白蠟塊中，最后用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片。建立布有250個(gè)陣列（樣本）不同級(jí)別的前列腺臨床標(biāo)本的組織芯片，正常前列腺組織標(biāo)本10例。

1.3免疫熒光雙重染色（FITC-CY3）和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

取組織芯片石蠟切片（4μm），58℃烤18 h，常規(guī)脫蠟，PBS洗3遍。檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)20 min，室溫冷卻20 min，PBS洗3遍。滴加20%蛋清，室溫靜置30 min，PBS洗3遍。滴加10%正常羊血清，室溫靜置20 min。加鼠E-cadherin/DSG2/pAkt/ Snail（1∶50）和CK8/18（1∶100）混合物，室溫孵育4 h，PBS洗3遍。加羊抗鼠IgG-FITC（1∶30）和生物素化羊抗兔IgG（1∶100）混合物，避光室溫孵育1 h，PBS洗3遍。加Streptavidin.Cy3，室溫孵育1 h，PBS 洗3遍，蒸餾水洗3 min，以防熒光碎滅劑封片。Leica TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡下掃描，計(jì)算機(jī)采集數(shù)據(jù)，數(shù)字成像。CK8/18陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光，E-cadherin/DSG2/pAkt/Snail陽性細(xì)胞核內(nèi)可見紅色熒光。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)和確切概率法，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，等級(jí)資料的關(guān)聯(lián)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫熒光分析原發(fā)性前列腺癌組織芯片中E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail的表達(dá)

128例前列腺癌患者組織標(biāo)本用福爾馬林固定和石蠟包埋后，分別提取直徑約為2 mm圓柱狀核心組織，并將這些組織嵌入到同一張切片，用于構(gòu)建前列腺癌組織芯片，以便能同時(shí)測(cè)定各蛋白在多個(gè)樣本中表達(dá)情況。前列腺癌組織芯片由上海芯超生物科技有限公司制作完成。前列腺癌組織芯片構(gòu)建時(shí)，首先由兩名病理科教授檢測(cè)各患者組織標(biāo)本，以確定腫瘤細(xì)胞高密度區(qū)，供公司參考。構(gòu)建好后，從前列腺癌組織芯片石蠟包埋中切取5μm組織用于免疫熒光分析。蛋白表達(dá)計(jì)分方法為發(fā)生免疫反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞占組織核的百分比（見圖1）。然后對(duì)每個(gè)樣本組織核的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。患者的臨床學(xué)特征見表1。

2.2前列腺癌組織中E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail蛋白的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明前列腺癌組織中E-cadherin和DSG2表達(dá)明顯低于前列腺組織，腫瘤高分化區(qū)細(xì)胞邊緣E-cadherin和DSG2蛋白高水平表達(dá)，而腫瘤低分化區(qū)域E-cadherin和DSG2表達(dá)下降（見圖2A、2B）。pAkt在前列腺癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均表達(dá)，且在腫瘤高分化區(qū)和低分化區(qū)內(nèi)均有較高表達(dá)（見圖2C）。此外，前列腺癌Snail核表達(dá)水平較正常組織也略有上升（見圖2D）。見表2。

2.3前列腺癌蛋白表達(dá)和臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

斯皮爾曼秩相關(guān)法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，E-cadherin和DSG2表達(dá)呈顯著正相關(guān)，pAkt表達(dá)升高同時(shí)Snail水平也升高，pAkt和Snail表達(dá)之間呈弱顯著正相關(guān)。此外，pAkt與E-cadherin表達(dá)成弱顯著正相關(guān)。pAkt與DSG2表達(dá)相關(guān)性要比pAkt和E-cadherin表達(dá)相關(guān)性還要弱，而且無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明E-cadherin和DSG2隨著pAkt表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)，E-cadherin和Snail之間存在微弱負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，DSG2和Snail表達(dá)呈微弱正相關(guān)，相關(guān)性也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示前列腺癌中Snail表達(dá)并不影響DSG2表達(dá)。

圖1　前列腺癌組織芯片制備及評(píng)價(jià)流程圖

表1　患者一般資料（n=128）

統(tǒng)計(jì)還發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)和所有檢查臨床病理特征之間存在負(fù)相關(guān)，盡管其相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而DSG2表達(dá)和所有臨床病理特征也呈負(fù)相關(guān)，DSG2表達(dá)分別與血清PSA濃度、Gleason評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，并且其相關(guān)性稍強(qiáng)于E-cadherin表達(dá)與血清PSA濃度、Gleason評(píng)分的相關(guān)性。總之，本結(jié)果表明，E-cadherin和DSG2表達(dá)下降提示前列腺癌患者血清PSA濃度含量增加、Gleason評(píng)分較高及病理分期更高。見表3。

2.4蛋白表達(dá)的臨床影響

E-cadherin表達(dá)70%處最接近于前列腺癌標(biāo)本E-cadherin表達(dá)平均值，因而選取該處為閾值，將患者分為E-cadherin高表達(dá)組（≥70%）與E-cadherin低表達(dá)組（<70%），比較兩組患者生存期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)≥70%組患者無復(fù)發(fā)生存率高于E-cadherin表達(dá)<70%組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3A，P=0.043）。E-cadherin表達(dá)<70%組患者生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間為104個(gè)月，而E-cadherin表達(dá)≥70%組患者120個(gè)月隨訪期結(jié)束后尚未達(dá)到生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間。同樣選取DSG2表達(dá)60%水平處為閾值，DSG2表達(dá)≥60%組患者無復(fù)發(fā)生存率高于DSG2表達(dá)<60%組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3B，P=0.01）；DSG2表達(dá)<60%患者生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間為104個(gè)月，而DSG2表達(dá)≥60%患者在120個(gè)月隨訪期結(jié)束后尚未達(dá)到生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間。總之，鈣E-cadherin和DSG2表達(dá)降低與前列腺癌生化復(fù)發(fā)有關(guān)，有望成為前列腺癌侵襲性的預(yù)后因子。

前列腺癌組織中pAkt表達(dá)水平（67%）高于正常前列腺組織（38%）。pAkt陰性前列腺癌患者無復(fù)發(fā)存活率高于pAkt陽性前列腺癌患者（見圖3C，P= 0.038），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。pAkt陽性患者生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間為106個(gè)月，而pAkt陰性患者在120個(gè)月隨訪期結(jié)束后尚未達(dá)到生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間。采用同樣方法測(cè)定Snail表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織Snail表達(dá)略高于正常前列腺組織（64% vs 60%）；Snail陰性前列腺癌患者無復(fù)發(fā)存活率比陽性患者要高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3D，P=0.263）。Snail陽性患者生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間為106個(gè)月，而陰性患者在120個(gè)月隨訪期接受后尚未達(dá)到生化復(fù)發(fā)中值時(shí)間。綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)pAkt表達(dá)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)有關(guān)，且這種相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明pAkt能夠作為前列腺癌侵襲性的預(yù)后因子。盡管如此，綜合本次結(jié)果表明E-cadherin和DSG2是更為有效的前列腺癌預(yù)后因子。

圖2　免疫熒光檢測(cè)E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail等蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)情況

表2　前列腺癌組織中E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail蛋白的表達(dá)情況

表3　各種蛋白表達(dá)關(guān)系及蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理學(xué)侵襲性特征的關(guān)系

圖3　4種蛋白與前列腺癌生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系

3　討論

PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過Snail介導(dǎo)前列腺癌E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制，而對(duì)DSG2表達(dá)無影響，此外，E-cadherin與DSG2表達(dá)調(diào)控?zé)o關(guān)[7]。本研究采用Spearman秩相關(guān)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin和Snail之間存在微弱負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示Snail可能是前列腺癌E-cadherin表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，但與DSG2表達(dá)抑制無關(guān)。本研究pAkt和E-cadherin表達(dá)呈弱顯著正相關(guān)，與以往研究結(jié)果不一致[8]，提示PI3K/Akt通路雖然抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，但是pAkt和E-cadherin表達(dá)確呈弱顯著正相關(guān)，提示前列腺癌中還存在其他E-cadherin表達(dá)抑制機(jī)制。

雖然研究證實(shí)前列腺癌中E-cadherin表達(dá)缺失，但關(guān)于鈣黏蛋白在前列腺癌侵襲性預(yù)測(cè)中的應(yīng)用還沒有大規(guī)模研究。此外，目前未見關(guān)于前列腺癌橋粒鈣黏蛋白表達(dá)的研究報(bào)道。黏合連接和橋粒參與前列腺上皮細(xì)胞間黏連[9-10]，因而了解典型鈣黏蛋白和橋粒鈣黏蛋白的表達(dá)將有助于深入探索錨定連接在前列腺癌發(fā)展過程中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)與正常前列腺組織比較，前列腺癌組織中DSG2表達(dá)顯著降低。此外，DSG2在腫瘤高分化區(qū)表達(dá)水平高，在腫瘤低分化區(qū)表達(dá)水平低，與E-cadherin分布相似。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示E-cadherin和DSG2表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin及DSG2和血清PSA濃度、Gleason評(píng)分及病理分期呈負(fù)相關(guān)。Kaplan- Meier存活曲線結(jié)果進(jìn)一步表明E-cadherin和DSG2等鈣黏蛋白低表達(dá)腫瘤細(xì)胞更可能有侵襲性，比鈣黏蛋白高表達(dá)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)E-cadherin和DSG2等鈣黏蛋白在前列腺癌發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，E-cadherin和DSG2有望成為侵襲性前列腺癌的預(yù)后因子。

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（張蕾編輯）

論著

Role of E-cadherin, DSG2, pAKT, and Snail in aggressive prostate cancer

Xiao-gen Kuang, Hui-hui Zhang, Han-feng Xu, Qing Li, You-han Cao
(Department of Urology, the First Affiliated Hospital, Nanhua University, Hengyang, Hunan 421001, China)

Abstract:Objective To investigate the roles of E-cadherin, DSG2, pAKT, and Snail in the development of prostate cancer, and to explore the potential association between E-cadherin, DSG2, pAKT, and Snail and the progression of prostate cancer．Methods The expression of E-cadherin, DSG2, pAKT and Snail in prostate cancer tissues was assessed by tissue microarrays. Results Compared with normal prostate, a significant decrease in the expression of E-cadherin was found in prostate cancer. The pAKT expression was detected in both cytoplasm and nucleus and was generally high in both well and poorly differentiated areas of the tumor. A strong and significant positive correlation between the expression of E-cadherin and DSG2 was found. Decreased expression of both E-cadherin and DSG2 was related to increased level of serum PSA concentration, higher Gleason scores and advanced pathological stage. Conclusions Tumor cells with reduced cadherin expression are more likely to be aggressive and have a greater potential for metastatic behavior. Cadherin plays a critical role in the progression of prostate cancer, and both E-cadherin and DSG2 may be useful prognostic markers of aggressive prostate cancer.

Keywords:prostate cancer; prognosis; tissue microarray; E-cadherin; DSG2; pAKT; Snail

收稿日期：2015-11-19

文章編號(hào)：1005-8982（2016）08-0038-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.008

中圖分類號(hào)：R737.25

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A