趨化因子CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平及其臨床意義

許靜

（河北省唐山市工人醫院內分泌二科，河北唐山063000）

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趨化因子CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平及其臨床意義

許靜

（河北省唐山市工人醫院內分泌二科，河北唐山063000）

摘要：目的探討趨化因子CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與臨床病理的關系。方法采用免疫組織化學方法、蛋白印跡法（Western blot）檢測120例甲狀腺乳頭狀癌、40例結節性甲狀腺腫及40例正常甲狀腺組織中CXCL14的表達水平，并分析其與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的關系。結果免疫組織化學結果表明，甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCL14蛋白陽性率（20.83%）較結節性甲狀腺腫（85.00%）、正常甲狀腺組織（75.00%）明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。Western blot結果表明，CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達量為（0.823±0.143），明顯低于結節性甲狀腺腫組織（1.211±0.012）和正常甲狀腺組織（1.219± 0.004），差異有統計學意義（P<0.05）。CXCL14蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結轉移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關（P<0.05）。CXCL14高表達組的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率明顯高于CXCL14低表達組（P<0.05）。結論CXCL14蛋白的表達可能成為判斷甲狀腺乳頭狀癌惡化程度及預后的指標。

關鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；趨化因子CXCL14；免疫組織化學法；蛋白印跡法

甲狀腺癌是內分泌腫瘤中最常見的，而甲狀腺乳頭狀癌又占甲狀腺癌的80%以上[1]，因此盡早對甲狀腺乳頭狀癌患者進行診治具有重要意義。腫瘤細胞的生長受到許多因素的影響，趨化因子與腫瘤的發生、發展、浸潤及轉移密切相關。[chemokine （C-X-C motif）ligand 14，CXCL14]是CXC趨化因子家族成員之一，在多種組織和細胞中均有表達。近期研究顯示，CXCL14在腎癌[2]、結直腸癌[3]、肺癌[4]、宮頸癌[5]、乳腺癌[6]中都呈低表達，而在部分骨肉瘤[7]、前列腺癌[8]、胰腺癌[9]中卻高表達，在甲狀腺乳頭狀癌中的作用報道較少。本研究應用免疫組織化學方法和蛋白印跡法（Western blot）檢測CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況，統計學分析其與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征及預后的相關性，為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷及治療提供理論依據。

1　資料與方法

1.1主要實驗材料

選取2003年2月-2004年10月于唐山市工人醫院行甲狀腺切除的甲狀腺乳頭狀癌組織120例，結節性甲狀腺腫40例，正常甲狀腺組織40例。甲狀腺乳頭狀癌患者中，女性68例，男性52例；<45歲56例，≥45歲64例；有包膜浸潤的65例，無包膜浸潤的55例；有轉移者70例，無轉移者50例；分化程度：低分化64例，高、中分化36例；按照2002年UICC（國際抗癌聯盟）的TNM進行分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期55例。所有標本的收集均征得患者及家屬的同意，部分組織置于液氮中保存，用于Western blot檢測，部分組織置于10%甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學法檢測。全部標本均行常規HE染色，明確病理診斷，病歷資料具有可比性。所有患者術前均無放療或者化療史。

1.2主要實驗試劑

免疫組織化學及Western blot試劑，兔抗人CXCL14多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3實驗方法及步驟

1.3.1免疫組織化學組織標本經常規脫水，石蠟包埋，4μm厚連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理后，進行0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液及微波抗原修復。室溫下濕盒中封閉20 min，滴加CXCL14兔抗人多克隆抗體（1∶100），置濕盒中4℃冰箱中過夜。第2天滴加二抗，然后置濕盒內孵育10 min，孵育完畢后進行二氨基聯苯胺（DAB）顯色，再進行蘇木精復染，常規脫水，最后進行封片。結果判定：以染色強度和陽性細胞百分率相乘得出的飽和指數（saturation index，SI）進行評估。染色強度：無陽性染色（0分），弱染（1分），中染（2分）,強染（3分）。染色區域如下：腫瘤細胞<25%（1分），25%～50%（2分），51%～75%（3分），>75%（4分）。該因子的表達水平由SI指數決定，SI指數≥4為腫瘤因子陽性表達，SI指數≤3為腫瘤因子陰性表達。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照組。

1.3.2Western blot方法取新鮮標本約100 mg，用考馬斯亮藍試劑盒定量。取50μg蛋白上樣到配置好的SDS-PAGE凝膠，電泳，將凝膠上的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗CXCL14兔抗人多克隆抗體（1∶100），室溫孵育2 h后4℃過夜，0.1% TBST液洗PVDF膜3×5 min，加入對應二抗,室溫孵育1 h洗膜3×5 min，洗膜后加入ECL發光液，曝光，顯影，定影，對X光底片拍照保存。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，計數資料3組間的比較先用χ2檢驗，在χ2檢驗有意義的基礎上再行χ2分割法進行兩兩比較；多組計量資料的比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗的方法；生存分析用Kaplan-Meier法，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達情況

免疫組織化學結果顯示，CXCL14陽性表達的甲狀腺組織呈淺黃色、棕黃色或黃褐色（見圖1）。甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中CXCL14的陽性表達率分別為20.83%（25/120）、85.00%（34/40）和75.00%（30/40），3組CXCL14陽性率的差異有統計學意義（χ2=56.803，P <0.05）。（見表1）。甲狀腺乳頭狀癌組CXCL14的陽性率明顯低于結節性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組，差異有統計學意義（χ2=53.065和39.019，P<0.01）；結節性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組CXCL14的陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=1.250，P >0.01）（見表1）。Western blot結果顯示（見圖2），CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達量為（0.823±0.143），明顯低于結節性甲狀腺腫組織（1.211±0.012）和正常甲狀腺組織（1.219±0.004），差異有統計學意義（P< 0.05），而其在結節性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

圖1　免疫組織化學檢測CXCL14在甲狀腺組織中的表達（×200）

2.2CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌的表達與臨床病理參數的關系

包膜浸潤中兩組CXCL14陽性率的差異有統計學意義（χ2=8.709，P<0.01），無包膜浸潤組CXCL14的陽性率明顯高于有包膜浸潤組；淋巴轉移中兩組CXCL14陽性率的差異有統計學意義（χ2=15.315，P<0.01），無淋巴結轉移組的CXCL14陽性率明顯高于淋巴結轉移組；臨床分期中兩組CXCL14陽性率的差異有統計學意義（χ2=6.064，P<0.05），Ⅰ、Ⅱ期臨床分期組CXCL14的陽性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期臨床分期組；分化程度中兩組CXCL14陽性率的差異有統計學意義（χ2=5.774，P<0.05），高、中分化組CXCL14的陽性率明顯高于低分化組。CXCL14的陽性率與患者的性別、年齡和發生部位無關，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表1　CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達情況

圖2　Western blot檢測CXCL14蛋白的表達

2.3CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌的表達與患者預后的相關分析

對120例隨訪資料齊全的病例進行生存分析，所有病例隨訪截止于2014年5月，隨訪時間120個月，繪制生存曲線（見圖3）。CXCL14低表達組共95例，其中36例存活、59例死亡，其生存率為37.89%；CXCL14高表達組共25例，其中20例存活、5例死亡，其生存率為80%。CXCL14高表達組病例的生存率明顯高于CXCL14低表達組（P<0.05）。

表2　CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

圖3　不同CXCL14表達的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存曲線

3　討論

近年來，甲狀腺癌患病率呈逐漸上升的趨勢[10]，其發病機制非常復雜。越來越多的趨化因子及其受體被證實與腫瘤的發生、發展有關，隨著研究的不斷深入，有些趨化因子已經成為抗癌的治療靶點。而CXCL14作為CXC趨化因子家族成員之一，其在甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前仍未明確。CXCL14最初是由Hromas等[11]于1999年從人類乳腺和腎臟組織中分離出來的，屬于腫瘤抑制基因。已有研究證實，它可以趨化單核細胞、B細胞、樹突狀細胞和NK細胞[12]。CXCL14參與調控體內許多生物學功能，如腫瘤相關血管的形成、炎癥免疫反應、宿主對腫瘤特異性免疫的激活以及腫瘤的自分泌調節等[13]。作為一個多功能趨化因子的CXCL14與多種腫瘤的發生發展都密切相關。研究顯示，CXCL14在腎癌、結直腸癌、肺癌、宮頸癌組織中的表達減少或者缺失[2-5]。Gu等[6]還發現，乳腺癌中CXCL14蛋白的表達與淋巴結轉移具有負相關性。因此，CXCL14在腫瘤增殖、轉移等方面起著重要作用。本實驗研究CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況，有助于進一步全面明確甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物學行為及機制，為甲狀腺乳頭狀癌患者的早期診斷、合理治療以及預后判斷找到新的靶點。

本研究運用免疫組織化學及Western blot技術檢測CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織、正常甲狀腺組織及結節性甲狀腺腫中的表達量，結果顯示，該蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平低于正常甲狀腺組織和結節性甲狀腺腫。這表明CXCL14蛋白可能在防止甲狀腺乳頭狀癌的發生中起到作用。已有研究證實，CXCL14可以通過抑制微血管系統和血管平滑肌細胞的趨化來抑制腫瘤血管的形成，從而抑制腫瘤細胞的成瘤和轉移[14]。

筆者還進一步對CXCL14蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌各臨床病理指標的關系進行分析，結果顯示，CXCL14蛋白的陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結轉移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關。在無包膜浸潤、無淋巴結轉移、臨床分期早和分化程度高的甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCL14表達相對增加。結果顯示，CXCL14與甲狀腺乳頭狀癌的進展密切相關，與甲狀腺乳頭狀癌的惡性程度呈負相關，可以抑制腫瘤的增殖、浸潤以及轉移。已有研究發現，在CXCL14陰性表達的人頭頸部鱗狀細胞癌系PCI-16中導入CXCL14基因會導致樹突狀細胞向腫瘤內部浸潤的能力增強，抗腫瘤的免疫反應也隨之增強[15]。因此，可以認為，CXCL14可能是通過啟動腫瘤免疫反應來抑制腫瘤的轉移和浸潤。生存分析結果顯示，CXCL14低表達組的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率明顯低于CXCL14高表達組，表明CXCL14低表達與甲狀腺乳頭狀癌患者的預后差有關。

綜上所述，本研究結果提示，CXCL14可能是預測甲狀腺乳頭狀癌惡性生物學行為的新標志，同時其基因也是抗腫瘤靶向治療的一個新的突破點。檢測腫瘤組織中CXCL14的表達水平對患者的早期診斷、合理治療以及預后判斷有一定的幫助。

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（張蕾編輯）

論著

Expression and significance of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma

Jing Xu
(Department of Endocrinology, the Workers Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000, China)

Abstract:Objective To analyze the expression of chemokine CXCL14 in papillary thyroid carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters. Methods Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the expression of CXCL14 protein in 120 cases of papillary thyroid carcinoma, 40 cases of nodular goiter and 40 cases of normal tissues, and its association with clinicopathologic parameters was analyzed. Results Immunohistochemistry showed that the expression of CXCL14 was positive in 20.83% of papillary thyroid carcinoma tissue, which was significantly higher than that in nodular goiter (85.00%) and nomal tissue (75.00%) (P < 0.05 ). Western blot showed that the relative amount of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma tissue was (0.823±0.143) significantly higher than in nodular goiter (1.211±0.012) and normal tissues (1.219±0.004) (P < 0.05). The expression of CXCL14 was correlated with envelope invasion, lymph node metastasis, clinical stage and differentiation (P< 0.05). The survival rate of patients with thyroid papillary carcinoma in high expression of CXCL14 was significantly higher than the low expression of CXCL14 (P < 0.05 ). Conclusions The expression of CXCL14 may be a marker for adjudging the malignancy and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

Keywords:papillary thyroid carcinoma; CXCL14; immunohistochemistry; Western blot

收稿日期：2015-11-25

文章編號：1005-8982（2016）08-0060-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.013

中圖分類號：R736.1

文獻標識碼：A