N-3不飽和脂肪酸對C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房結構重構的影響

付國強， 曹義戰， 何乾鋒， 田小溪， 王伯良(第四軍醫大學唐都醫院急診科,西安　710038； 通訊作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)

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N-3不飽和脂肪酸對C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房結構重構的影響

付國強， 曹義戰， 何乾鋒， 田小溪， 王伯良*(第四軍醫大學唐都醫院急診科,西安710038；*通訊作者，E-mail: wliang@fmmu.edu.cn)

摘要：目的觀察N-3不飽和脂肪酸飼養對C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房細胞氧化應激水平變化及心房結構重構的影響。方法流式細胞儀檢測心房肌細胞活性氧，比較C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不飽和脂肪酸飼養的C57BL/6-PD-1-/-小鼠(每組10只，雄性，6-8周齡)的心房肌細胞氧化應激水平，Masson染色檢測心房肌纖維化水平，電子天平稱重檢測心臟/體質量比值變化。結果與C57BL/6小鼠比較，C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細胞細胞內活性氧水平明顯升高(P<0.05)，心房肌Masson染色顯示基因敲除后心房肌出現了明顯纖維化、心臟/體質量比值明顯升高(P<0.001)，N-3不飽和脂肪酸飼養后的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細胞內活性氧水平(P<0.05)及心房肌纖維化、心臟/體質量比值(P<0.01)升高趨勢得到明顯遏制。結論PD-1基因敲除C57BL/6小鼠的心房肌細胞活性氧水平升高，同時出現了的心房結構重構，N-3不飽和脂肪酸飼養能夠遏制這種變化趨勢。

關鍵詞：PD-1基因敲除；N-3不飽和脂肪酸；活性氧；心房結構重構；心房纖顫

心房顫動(房顫)是臨床上最常見并且危害嚴重的心律失常疾病，普通人群的發病率約為2%，且隨著年齡的增長發病率迅速升高，與非房顫患者相比，房顫患者死亡率及心血管病事件風險明顯升高[1]。房顫的發病機制比較復雜，目前普遍認為房顫起源于存在于心房的多發折返環[2]，但對于多發折返環的產生機制仍然未得到完全闡明。近年來，有研究證實心房結構重構能夠促進心房內多發折返環生成而使得房顫發病易感性增高[3]。

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面的CD28家族的一個重要的負性共刺激分子，PD-1基因的缺失或PD-1及其配體途徑阻斷可以增強T細胞活性，提高體內的炎癥水平[4]。氧化應激主要指在細胞代謝過程中所產生的對機體具有損害作用的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。在許多病理生理學條件下，炎癥可以加強氧化應激水平，反之亦然。已有研究表明，炎癥和氧化應激與心房結構重構密切相關[5]。

那么，伴隨著PD-1-/-小鼠機體的高炎癥狀態是否會影響小鼠心房肌細胞氧化應激水平，并進而對小鼠心房結構重構產生影響？本研究應用抗炎藥物N-3不飽和脂肪酸飼料添加，對比了C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和N-3不飽和脂肪酸飼養的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌氧化應激水平和心房心肌纖維化水平，心臟/體質量比值變化，旨在探究炎癥、氧化應激與心房結構重構之間的關系。

1材料和方法

1.1主要儀器及試劑

主要儀器：BD FACScalibur流式細胞儀(美國BD公司)，Langendorff 離體灌注儀(美國 Radnoti 公司)，石蠟切片機，電子天平(美國Sartorius公司)

主要試劑：二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA，美國Sigma-Aldrich 公司)，牛血清白蛋白、無血清培養基、膠原酶Ⅰ、胰蛋白酶 (美國 Sigma 公司)。

1.2實驗動物

C57BL/6-PD-1-/-小鼠由日本京都大學的Tasuku Honjo教授免費轉讓，實驗小鼠分為3組：C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和、N-3不飽和脂肪酸飼養的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每組10只，雄性，6-8周齡。實驗前均飼養于第四軍醫大學基礎部神經生物教研室SPF級實驗動物中心。實驗開始前4周，N-3不飽和脂肪酸飼養的C57BL/6-PD-1-/-小鼠，每只小鼠飼料中添加二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸(EPA+DHA),各2.5 mg/d。

1.3血清不飽和脂肪酸濃度檢測

參考相關文獻中的方法[6]，通過氣相色譜法檢測血清不飽和脂肪酸濃度，在內標準磷脂酰膽堿存在的情況下提取血清中的脂類物質，然后利用薄層色譜法從血清中性脂質中分離提取磷脂質，最后在磷脂質中提取甲基脂肪酸類脂質并在液相色譜儀上進行分析。

1.4Langendorff小鼠離體心臟灌注獲取心房肌細胞

脫頸處死小鼠后迅速摘除心臟并主動脈插管，懸掛于Langendorff離體灌注儀上，通過主動脈實現冠狀動脈逆灌注，在冠狀動脈灌注過程中保持灌注液溫度在37 ℃并加入100%的氧氣。最初用普通的臺氏液灌注心臟清洗血液，然后用無鈣臺氏液灌注2 min，最后心臟用0.14 mg/ml膠原酶(Sigma-Aldrich)液灌注15 min左右。灌注結束后，分離心房并剪成碎片，用玻璃移液管吹散這些碎片形成單個細胞。800 r/min離心5 min，將細胞沉淀與含10%胎牛血清的DMEM 培養基混勻，成纖維細胞差速貼壁1 h，更換培養基，無菌無毒條件下，置37 ℃二氧化碳培養箱培養以備后續試驗。

1.5心房肌細胞活性氧(ROS)檢測

取培養24 h的心房肌細胞，用0.1%胰酶1 ml滴于培養瓶，覆蓋瓶底，當細胞開始收縮棄去胰酶，PBS溫和清洗1次，放入2 ml無血清培養基，用彎頭吸管反復吹打，制備單個細胞懸液。心房肌細胞用無血清培養基清洗2次，種植于96孔培養板，調整細胞濃度至106/ml，加用DMSO配置的濃度為2 μmol/L的二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)0.5 ml，并在37 ℃培養箱中避光孵育20 min，移入上樣管上流式細胞儀記錄數據。DCF的激發波長為495 nm，發射波長為525 nm，通過FL1檢測。

1.6心臟/體質量比值測定及病理學檢查

實驗小鼠頸椎脫臼處死后用電子天平稱量體質量(BW)后，迅速將心臟取出，PBS液中去除結締組織及殘血，濾紙吸干心臟表面殘留液體，用電子天平稱心臟質量(HW)，計算心臟/體質量比值(HW/BW)。然后將右心房剪下，標本放入Bouin氏液中固定，供組織病理學檢查使用。常規石蠟包埋、切片。切片在Masson三色染色液(第四軍醫大學基礎部病理學實驗室)中浸入5 min，0.2%醋酸清洗10 s后用5%磷鎢酸處理10 min，然后用0.2%醋酸溶液再清洗2次，2%苯胺藍溶液染色5 min，醋酸清洗2次后梯度酒精脫水，二甲苯清洗中性樹膠封片。

1.7統計學分析

2結果

2.1血清不飽和脂肪酸濃度比較

與C57BL/6組比較，血清不飽和脂肪酸濃度在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組未見明顯升高，但經過4周N-3不飽和脂肪酸喂養后，PUFAs組血清不飽和脂肪酸濃度較C57BL/6-PD-1-/-組明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.001，見表1)。

表1三組實驗動物血清不飽和脂肪酸濃度比較 (%)

Table 1Concentrations of N-3 fatty acids in plasma phospholipids in three groups (%)

小鼠種類 N-3PUFAsEPA+DHAC57BJ65.7±0.63.1±0.6C57BL/6-PD-1-/-5.8±0.73.2±0.7N-3PUFA-C57BL/6-PD-1-/-8.2±0.9*5.7±1.0*

與C57BL/6-PD-1-/-小鼠比較，*P<0.001

2.2心房肌細胞氧化應激水平檢測

通過流式細胞儀檢測心房肌細胞(每組10 000個)內活性氧結果顯示，C57BL/6-PD-1-/-小鼠較C57BL/6小鼠心房肌細胞平均熒光強度明顯升高(30.29±2.26vs25.02±1.02，P<0.05)；飼喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細胞平均熒光強度較未飼喂組明顯下降(27.20±1.71vs30.29±2.26，P<0.05)，差異具有統計學意義。

2.3HW/BW比值比較

C57BL/6-PD-1-/-小鼠和C57BL/6小鼠比較，HW/BW比值明顯升高[(5.469±0.098)mg/gvs(5.145±0.089)mg/g，P<0.001]，飼喂N-3 PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值上升得到較明顯的抑制[(5.328±0.101)mg/gvs(5.469±0.098)mg/g，P<0.01]。

2.4心房病理學檢查

心房肌Masson三色染色發現，在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組出現了比較嚴重的心肌纖維化，而C57BL/6小鼠組未發現，飼料添加PUFA的C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纖維化程度有較明顯的下降趨勢。在C57BL/6-PD-1-/-小鼠組中可以看到大量染為藍色的膠原纖維，成團塊狀分布。而C57BL/6小鼠組心肌組織中中沒有看到膠原纖維，相對C57BL/6-PD-1-/-小鼠組，PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠組的心肌纖維化程度得到了較明顯的抑制。表現在染為藍色的膠原纖維明顯減少，呈現條索狀，且數量明顯減少(見圖3)。

圖1　三種小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心臟大體比較Figure 1　Comparison of gross of heart among three groups

圖2　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠HW/BW比值比較Figure 2　Comparison of HW/BW ratio among three groups

A.C57BL/6小鼠(×200)；B.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；C.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×200)；D. C57BL/6小鼠(×400)；E.C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)；F.N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠(×400)圖3　C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠及N-3 PUFA-C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌纖維化程度比較Figure 3　Comparison of atrial myocardial fibrosis among three groups

3討論

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面的CD28家族的一個重要的負性共刺激分子，它通過和其配體程序性死亡因子配體-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2)結合后負性調節免疫反應[7]。敲除該基因能夠增強T細胞活性，提高體內的炎癥水平。1998年有學者[8]成功制作出了PD-1基因敲除(PD-1-/-)小鼠，有研究證實PD-1-/-小鼠分泌炎性因子的能力明顯增強[9]。氧化應激是指機體內氧化和抗氧化失衡，導致某些自由基的產生和抗氧化防御之間出現嚴重失衡的一種病理狀態。在許多病理生理情況下，炎癥和氧化應激密切相關，高炎癥水平往往伴隨著高氧化應激水平。研究表明炎癥因子可以通過白細胞膜上NADPH氧化酶復合物的氧化作用產生活性氧，放大氧化應激的反應[10]；炎性細胞因子(IL-6，TNF-a)可直接誘導中性粒細胞產生大量氧自由基[11]，提高機體氧化應激水平，而氧自由基又可以進一步刺激炎癥細胞活化。因此，氧化應激和炎癥反應形成螺旋上升式的惡性循環。本研究結果顯示：C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細胞氧化應激水平明顯升高，表明PD-1基因敲除小鼠本身伴隨的高炎癥狀態影響了小鼠心房肌細胞的氧化應激水平，使其明顯升高。同時觀察到PD-1基因敲除小鼠出現了明顯的心房肌纖維化和心臟/體質量比值增加，即出現了心肌結構重構。

炎癥、氧化應激和心房結構重構密切相關，研究表明：心房顫動患者的心房組織中通常存在炎癥細胞浸潤和炎癥因子高表達[12]；氧化應激主要產物是對機體具有損害作用ROS，ROS在血管緊張素Ⅱ所誘導的心肌重構中發揮了重要作用[12]；Ras相關的C3肉毒素底物1(ras related C3 botulinum toxin substrsye 1，Rac1)蛋白能夠通過激活氧化應激反應促進心房纖維化及心肌細胞肥大[14]。因此C57BL/6-PD-1-/-小鼠體內高炎癥狀態和心房肌細胞氧化應激水平升高可能導致了心房肌纖維化和心臟/體質量比值增加。

飼料添加N-3不飽和脂肪酸(PUFAs)能夠降低實驗動物體內系統性炎癥水平[15]。PUFAs主要包括兩個基本類型：N-6和 N-3，其中N-3 PUFAs人體不能合成，必須依靠食物攝取。N-3 PUFAs主要有三類：來源于植物的α-亞油酸(LNA:alpha-linolenic acid)，主要來源于海洋脊柱動物類和魚油中的十二碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)以及二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)。本實驗應用DHA和EPA飼料添加補充N-3 PUFAs。結果顯示： N-3多聚不飽和脂肪酸飼料添加能夠通過其抗炎效應對C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌重構發揮了一定的抑制作用，表現在心肌纖維化程度、心臟/體質量比值上升均得到了一定的抑制。由于N-3多聚不飽和脂肪酸具有確切的抗炎效果，研究結果提示炎癥和氧化應激水平升高可能導致了C57BL/6-PD-1-/-小鼠心肌結構重構。由于心房重構和房顫發生發展密切相關，實驗結果也高度提示飼料添加N-3多聚不飽和脂肪酸能夠降低炎癥所導致的房顫發病易感性，對于房顫具有一定的預防作用。

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Effects of N-3 polyunsaturated fatty acids on atrial structure remodeling by inhibiting atrial myocytes oxidative stress in C57BL/6 PD-1-/-mice

FU Guoqiang, CAO Yizhan, HE Qianfeng, TIAN Xiaoxi, WANG Boliang*

(DepartmentofEmergency,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail:wliang@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of dietary N-3 polyunsaturated fatty acids(PUFA) supplementation on the oxidative stress level and atrial structure remodeling in PD-1 deficient mice.MethodsThe level of cardiac atrium myocytes oxidative stress, heart weight/body weight(HW/BW)ratio and atrial myocardial fibrosis level were examined in male C57BL/6 mice(n=10), C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10) and PUFA-C57BL/6-PD-1-/-mice(n=10). ResultsThe level of atrium myocytes oxidative stress and the HW/BW ratio in C57BL/6-PD-1-/-group were significantly higher than in C57BL/6 group(P<0.05 or P<0.001). The atrial myocardial fibrosis was detected in C57BL/6-PD-1-/-group but not in C57BL/6 group. After dietary N-3 PUFA supplementation, the level of atrium myocytes oxidative stress, HW/BW ratio and atrial myocardial fibrosis were dramatically attenuated in PUFA-C57BL/6-PD-1-/-group(P<0.05). ConclusionThe higher level of atrium myocytes oxidative stress in the C57BL/6PD-1-/-mice results in the atrial structural remodeling. Dietary N-3 PUFA supplementation can attenuate the atrial structure remodeling.

Key words:PD-1 deficiency;N-3 polyunsaturated fatty acids;reactive oxygen species;atrial structure remodeling;atrial fibrillation

[收稿日期：2015-11-04]

作者簡介：付國強，男，1976-09生，博士，主治醫師,講師，E-mail:fgq229@yeah.net.

中圖分類號：R363

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0001-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.001

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81070161)