脂多糖對大鼠肝星狀細胞caspase-1及IL-18表達的影響

潘良盈， 劉震雄， 張　哲， 趙　麗， 李慧艷， 趙曙光(第四醫軍大學唐都醫院消化內科，西安　710038；通訊作者，E-mail：zsg1203@126.com)

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脂多糖對大鼠肝星狀細胞caspase-1及IL-18表達的影響

潘良盈， 劉震雄， 張哲， 趙麗， 李慧艷， 趙曙光*(第四醫軍大學唐都醫院消化內科，西安710038；*通訊作者，E-mail：zsg1203@126.com)

摘要：目的觀察脂多糖(LPS)誘導大鼠肝星狀細胞NLRP3活化時caspase-1及IL-18表達的變化。方法常規培養大鼠肝星狀細胞，用RT-PCR檢測LPS誘導肝星狀細胞2 h時NLRP3炎癥小體及caspase-1,IL-18 mRNA的表達，熒光定量PCR檢測不同濃度LPS(0，0.05，0.1，0.2 μg/ml)誘導肝星狀細胞不同時間(30，60，120 min)時caspase-1及IL-18 mRNA的表達。結果LPS誘導肝星狀細胞在30 min和60 min時，隨著LPS濃度增加caspase-1和IL-18 mRNA表達增高，0.1和0.2 μg/ml組均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)；120 min時，隨著LPS濃度增加caspase-1和IL-18 mRNA表達逐漸降低，其中0.05 μg/ml組較0 μg/ml組顯著降低(P<0.05)。隨LPS誘導時間延長，0.05 μg/ml組caspase-1 和IL-18 mRNA表達逐漸增加；在0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組，caspase-1 mRNA 表達逐漸降低，其中120 min組較30 min組顯著降低(P<0.05)；IL-18 mRNA表達水平先升高后降低，均在60 min時達最高水平(P<0.01)。結論LPS能夠促進肝星狀細胞炎癥小體NLRP3表達，激活NLRP3，誘導HSC-T6分泌caspase-1及IL-18。

關鍵詞：脂多糖；非酒精性脂肪性肝炎；肝星狀細胞；NLRP3炎癥小體

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)發病機制尚不明確[1]。NASH動物模型及患者常有代謝性內毒素血癥，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)經門靜脈系統進入肝臟，誘導庫普細胞(Kuppfer cell，KC)活化，產生炎癥因子，觸發肝臟胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，在NASH發病中發揮重要作用[2-4]。同時，LPS作為Toll樣受體4的配體，也能活化炎癥小體NLRP3，產生具有酶活性半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)，介導IL-1β和IL-18等炎癥因子由前體轉化為活性形式并分泌到胞外，參與肝臟IR的發生[5]。已證實，NLRP3與NASH的發生密切相關，敲除NLRP3可以阻止高脂飲食導致的IR、肥胖和NASH的進展[6-9]。目前研究LPS誘導肝臟NLRP3活化多集中在Kuppfer細胞和肝細胞，有研究[10]表明肝星狀細胞也表達NLRP3，LPS誘導肝星狀細胞NLRP3炎癥小體活化對caspase-1及其下游炎癥因子表達如何影響，目前報道不多[11]。本研究利用大鼠肝星狀細胞，觀察LPS誘導NLRP3活化時caspase-1和IL-18表達的變化，對于進一步豐富LPS參與NASH發病的機制有重要意義。

1材料與方法

1.1細胞株與主要試劑

實驗用大鼠肝臟星狀細胞HSC-T6購自中國科學院上海生物細胞庫。無抗生素的DMEM、0.5 g/L胰酶EDTA溶液購自美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal calf serum，FBS)購自美國Gibco公司；LPS購自美國Sigma公司；RNA simple Total RNA Kit、DNA maker購自北京Tiangen公司；PrimeScript TMRT Master Mix、Premix TaqTM、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKara 公司。

1.2LPS刺激細胞實驗

常規培養大鼠肝星狀細胞HSC-T6，使用含10% FBS的DMEM培養基，于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養箱中培養。取處于對數期的大鼠肝星狀細胞HSC-T6，采用0.25%胰酶消化，將HSC-T6細胞按5×106/ml接種于6孔板(用含10%胎牛血清的DMEM稀釋)，培養24 h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM饑餓16 h，加入不同終濃度的LPS(0，0.05，0.1，0.2 μg/ml)，各組分別培養30，60，120 min。

1.3提取總RNA轉錄合成cDNA

應用離心柱型總RNA提取試劑盒，按試劑盒的說明書進行操作分別提取總RNA，并用超微量分光光度計測定其濃度和純度，重復測定3次，計算總RNA的濃度，A260/A280在1.8-2.0之間。用PrimeScript TMRT Master Mix 試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作，反轉錄RNA得到cDNA模板，反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4反轉錄PCR(RT-PCR)、實時定量PCR(real time PCR)檢測LPS誘導后HSC-T6中caspase-1、IL-18 mRNA表達

根據Genbank中公布的各待測基因的基因序列設計引物，NLRP3上游引物：5′-TGC ATG CCG TAT CTG GTT GT-3′，下游引物：5′-AGC TGA GCA AGC TAA AGG CT-3′，產物大小134 bp；caspase-1上游引物：5′-CCG AGT GGT TCC CTC AAG TT-3′，下游引物：5′-CCG ACT CTC CGA GAA AGA TG-3′，產物大小158 bp；IL-18上游引物：5′-TGG AAT CAG ACC ACT TTG GC-3′，下游引物：5′-GTC TGG TCT GGG ATT CGT TG-3′，產物大小150 bp；內參GAPDH上游引物：5′-TAC CCA CGG CAA GTT CAA CG-3′，下游引物：5′-CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG-3′，產物大小122 bp。RT-PCR反應體系為：Premix Taq 25 μl，模板cDNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，滅菌蒸餾水加至50 μl。反應條件為：98 ℃ 10 s，56-57 ℃30 s，72 ℃ 1 min，30個循環。real time PCR反應體系如下：SYBR?Premix Ex Taq 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)1.0 μl，下游引物(10 μmol/L)1.0 μl，模板cDNA 12 μl，加dH2O 至25.0 μl。反應條件如下：95 ℃預變性30 s，PCR反應95 ℃ 3 s，56 ℃ 30 s，40個循環。

1.5數據處理與統計學分析

RT-PCR 瓊脂凝膠電泳經成像所得圖像用Lane 1D分析軟件分析處理，real time PCR所得數據采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。采用SPSS 13.0軟件，結果用表示，采用方差分析或LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1LPS誘導大鼠肝星狀細胞表達caspase-1和IL-18 mRNA

用0,0.05,0.1,0.2 μg/ml LPS誘導大鼠肝星狀細胞，檢測30,60,120 min三個時間點caspase-1和IL-18 mRNA的表達。結果顯示，三個不同濃度LPS在不同時間點均可誘導肝星狀細胞表達caspase-1和IL-18 mRNA(見圖1)。

M.Marker；1-4.分別為0,0.2，0.1，0.05 μg/ml LPS處理組； 5.GAPDH圖1　LPS誘導大鼠肝星狀細胞2 h時NLRP3、caspase-1和IL-18 mRNA的表達Figure 1　Expression of NLRP3,caspase-1 and IL-18 mRNA in rat hepatic stellate cells induced by LPS for 2 h

2.2不同濃度LPS誘導肝星狀細胞對不同時間caspase-1 mRNA表達的影響

LPS誘導肝星狀細胞在30 min和60 min時，隨著LPS濃度增加caspase-1 mRNA表達增高，0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)，120 min時間點，隨著LPS濃度增加caspase-1 mRNA表達逐漸降低，其中0.05 μg/ml組較0 μg/ml組顯著降低(P<0.05)。隨LPS誘導時間延長，0.05 μg/ml組caspase-1 mRNA表達逐漸增加(P>0.05)；0.1 μg/ml組和0.2 μg/ml組表達逐漸降低，其中120 min時較30 min時顯著降低(P<0.05，見表1)。

組別30min60min120min0μg/ml組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00 0.05μg/ml組1.48±0.351.52±0.342.07±0.35*0.1μg/ml組2.22±0.38*1.76±0.16*1.60±0.48#0.2μg/ml組2.39±0.63*2.28±0.31*1.36±0.40#

與0 μg/ml相比，*P<0.05；與30 min相比，#P<0.05

2.3不同濃度LPS誘導肝星狀細胞對不同時間IL-18 mRNA表達的影響

LPS誘導肝星狀細胞在30 min和60 min時，隨著LPS濃度增加IL-18 mRNA表達均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)；在120 min時間點，隨著LPS濃度增加IL-18 mRNA表達逐漸降低，但各組間無統計學差異(P>0.05)。隨LPS誘導時間延長，0.05 μg/ml組IL-18 mRNA表達增高，其中120 min時較30 min時顯著增高(P<0.01)；0.1 μg/ml和0.2 μg/ml組表達先增加后降低，60 min時表達最高，且顯著高于其余兩個時間點(P<0.05，見表2)。

與0 μg/ml組相比，*P<0.05，**P<0.01；與30 min相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與120 min組相比，#P<0.01

3討論

近年NASH發病率明顯上升，已成為慢性肝病及隱源性肝硬化的主要病因之一[1]，但其發病機制尚未完全闡明。正常腸道菌群與高脂飲食相互作用產生代謝性內毒素血癥，LPS水平增高，經門靜脈系統進入肝臟誘導KC浸潤、活化，合成多種炎癥因子，觸發肝臟IR，導致NASH發生。研究表明，這些腸道來源的LPS可以引起肝臟NLRP3活化，敲除NLRP3對NASH發病發揮保護作用[5,8,9,12]。新近研究發現[10]，NLRP3表達水平與肝臟細胞種類有關，KC和肝竇內皮細胞高度表達，肝星狀細胞中度表達，原代培養肝細胞幾乎不表達。既往對LPS誘導肝臟NLRP3活化，研究對象多為肝細胞和Kuppfer細胞，而對肝星狀細胞研究較少[8,10-12]。本研究表明，LPS能夠誘導肝星狀細胞NLRP3活化，且進一步誘導caspase-1及IL-18的表達，有可能通過此途徑參與NASH的發病。

NLRP3與凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和caspase-1相互結合形成炎癥小體[13]，NLRP3通過感受肥胖所導致的危險信號，促進肥胖導致的炎癥和IR，參與NASH的發病。Csak等[12]發現NASH小鼠肝臟NLRP3、ASC、caspase-1表達高于對照組，提示NASH中存在炎癥小體活化。分別缺失caspase-1、ASC及NLRP3的小鼠，高脂飲食誘導的肝細胞脂肪變性輕于對照組，且缺乏caspase-1的小鼠脂肪組織中巨噬細胞的數量下降。敲除NLRP3改善高脂飲食引起的小鼠肝臟和脂肪組織IR[8]。因此，caspase-1表達是LPS誘導細胞產生炎癥因子的重要環節，本研究表明， LPS能夠誘導肝星狀細胞NLRP3活性升高，進而導致caspase-1 mRNA表達增加，且隨LPS濃度增高而表達上調，隨時間延長而表達減少，與以前研究[14]報道LPS導致肝臟NLRP3活化時caspase-1 mRNA表達特點并不一致，可能與該研究檢測的是肝臟各種細胞受LPS刺激后caspase-1 mRNA的總和，而各種細胞受LPS刺激后caspase-1 mRNA表達的規律并不完全一致有關。

NLRP3炎癥小體在被激活前處于自身抑制狀態，NLRP3與配體結合后，形成成熟的caspase-1，剪切無活性的IL-1β和IL-18前體為成熟的活性形式，分泌到細胞外發揮生物學效應。缺乏caspase-1小鼠導致IL-1β和IL-18合成和分泌障礙。目前研究證實，IL-1β和IL-18與IR的發生關系密切[8,9,15]。清除NLRP3炎癥小體能夠降低IL-18水平，改善脂質細胞的代謝功能，并增強其胰島素敏感性[8]。因此，caspase-1的表達對于其下游細胞因子的表達發揮非常重要的作用。本研究表明，LPS能夠誘導肝星狀細胞NLRP3活性升高，隨后使caspase-1表達增加，促進IL-18的合成。IL-18 mRNA表達隨LPS濃度增加而下降，隨時間延長而表達增加,與在體觀察到肝臟IL-18總的變化特點相一致[14]。

總之，本研究表明LPS能夠誘導肝星狀細胞NLRP3活化，進而導致caspase-1和IL-18表達上調，可能通過各種炎癥因子相互作用，導致肝臟IR。由于肝星狀細胞活化與肝臟纖維化的發生密切相關，觀察NLRP3活化對肝纖維化的影響可能有助于進一步闡明星狀細胞在NASH發病中的作用。

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Effects of lipopolysaccharide on caspase-1 and IL-18 expression in rat hepatic stellate cells

PAN Liangying, LIU Zhenxiong, ZHANG Zhe, ZHAO Li, LI Huiyan, ZHAO Shuguang*

(DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;*Correspondingauthor,E-mail:zsg1203@126.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of caspase-1 and IL-18 in hepatic stellate cells when NLRP3 activation is induced by lipopolysaccharide(LPS). MethodsRat hepatic stellate cells were conventionally cultured. The expression levels of NLRP3, caspase-1 and IL-18 mRNA in hepatic stellate cells induced by LPS for 2 h were detected by RT-PCR, and the caspase-1 and IL-18 mRNA expression levels were detected by quantitative PCR at different time points(30,60,120 min) when stellate cells were induced by different doses of LPS(0,0.05,0.1,0.2 μg/ml).Results At 30 min and 60 min, the caspase-1 and IL-18 mRNA expression levels increased in a concentration-dependent manner, and they were significantly higher in 0.1 μg/ml and 0.2 μg/ml group than in 0 μg/ml group(P<0.05). At 120 min, the expression of caspase-1 and IL-18 mRNA was decreased in a concentration-dependent manner, and it was significantly lower in 0.05 μg/ml group than in 0 μg/ml group(P<0.05).With the enlargement of treatment, the caspase-1 and IL-18 mRNA expression was increased in 0.05 μg/ml group, while the caspase-1 mRNA expression decreased in 0.1 μg/ml and 0.2 μg/ml group, it was significantly lower at 120 min than at 30 min(P<0.05). The IL-18 mRNA expression was increased first and then reduced, and peaked at 60 min(P<0.01).ConclusionLPS can promote the inflammasome NLRP3 expression in hepatic stellate cells, activate the NLRP3, and thus induce the HSC-T6 secreting caspase-1 and IL-18.

Key words:LPS;nonalcoholic steatohepatitis;stellate cells;NLRP3 inflammasome

[收稿日期：2015-09-24]

作者簡介：潘良盈，女，1987-08生，在讀碩士，E-mail：panly1025@163.com.

中圖分類號：R575

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0010-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.003

基金項目：國家自然基金資助項目(81170376，81270485)