胚胎發(fā)育相關基因-1對人肺癌細胞增殖及凋亡的影響

史紅陽， 鄧文靜， 張玉萍， 張德信(西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安　710004; 通訊作者，E-mail：shihy2003@126.com)

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胚胎發(fā)育相關基因-1對人肺癌細胞增殖及凋亡的影響

史紅陽*， 鄧文靜， 張玉萍， 張德信(西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安710004;*通訊作者，E-mail：shihy2003@126.com)

摘要：目的探討一種新近克隆的胚胎發(fā)育相關基因-1(embryonic development associated gene-1，EDAG-1)對人肺癌細胞增殖及凋亡的影響。方法構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-EDAG-1，以脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人肺癌細胞A549和H460，分別通過qRT-PCR和Western blot檢測EDAG-1基因mRNA和蛋白的表達，同時檢測細胞的增殖及凋亡。結果轉(zhuǎn)染EDAG-1后，A549和H460細胞中EDAG-1的mRNA和蛋白表達水平均顯著性升高(P<0.01)。與轉(zhuǎn)染空載體的A549和H460對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染EDAG-1的A549和H460細胞增殖明顯受到抑制，細胞凋亡率顯著性升高(P<0.01)。結論EDAG-1可以抑制肺癌細胞增殖，促進其凋亡，其可能在肺癌的發(fā)生中起著重要作用。

關鍵詞：胚胎發(fā)育相關基因；肺癌；基因表達；細胞增殖；細胞凋亡

惡性腫瘤中存在可自我更新及多向分化成各種癌細胞的初始未分化癌細胞[1]。有關研究證實多種調(diào)控基因，如c-myc，n-myc，c-myb，p53，c-fos，c-ski等，參與細胞增殖、分化與癌變過程。研究調(diào)控基因作用將有助于揭示細胞惡性變化的生物學機制。定位于9q22的胚胎發(fā)育相關基因-1(embryonic develop associated gene-1，EDAG-1)，該基因mRNA穩(wěn)定性差，半衰期短[2,3]，其mRNA 3′端非翻譯區(qū)序列含2個拷貝AUUUA結構，而該結構多出現(xiàn)于生長因子及原癌基因的3′端序列[4]。據(jù)此，EDAG-1可能具有重要的生物學意義。

大量研究報道表明，EDAG-1基因參與調(diào)控細胞增殖與分化過程，在某種程度上其高表達與維持細胞未分化狀態(tài)有關[2]，可能與基因表達發(fā)生改變或脫離正常調(diào)控途徑有關。分子機制研究表明，EDAG通過某些途徑激活c-myc、Bcl-2及Bcl-xl等凋亡相關蛋白的表達[2,5-8]。EDAG在多種白血病細胞系(如K562、KG-la、Jukret、Namalva細胞系)中表達水平均較高，而在HL-60、NB4和6J-1細胞系中則沒有表達[9]。采用電轉(zhuǎn)染法將過表達EDAG質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)染至TF-1細胞株中，撤除細胞因子后其存活及抗凋亡能力均得以提高，即EDAG過表達能抑制由細胞因子撤除而誘導的細胞凋亡[10]。EDAG轉(zhuǎn)染人白血病細胞系K562后能明顯提高其增生能力，與細胞內(nèi)自激因子作用機制相似[11]。而EDAG敲除小鼠對低劑量輻射誘導的損傷更加敏感[12]。急性白血病患者中EDAG高表達與治療效果相關[13]。分析EDAG-1基因高表達的原因，可能是某些改變使其表達脫離正常調(diào)控途徑[14]。

目前認為肺癌的發(fā)生與細胞增殖、分化及凋亡的失衡相關，是導致其無限制生長的重要原因。EDAG是一種造血組織特異表達，對造血細胞增殖、分化起重要調(diào)控作用的新基因[2,13]，可能參與了造血發(fā)生多個過程的調(diào)控，但對其功能及作用機制尚缺乏深入的了解。既往研究發(fā)現(xiàn)，EDAG-1基因與細胞增殖與分化調(diào)控密切相關，且其可能參與細胞的凋亡過程[2,13,15]。EDAG-1在正常人肺組織中表達量極低或不表達[4]，其在肺癌中的表達尚不明確。基于此，本文擬探討EDAG-1基因與肺癌的關系。因此，通過體外構建EDAG-1真核表達載體并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人肺癌細胞系內(nèi)，觀察重組pcDAN3.1(+)-EDAG-1真核表達載體對細胞增殖及凋亡的影響，探討EDAG-1對于肺癌惡性生物學行為的影響。

1材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、細胞、試劑

EDAG-1基因片段(約1 500 bp)由上海Sangon公司合成。大腸桿菌JM109由本實驗室保存；真核表達載體pcDNA3.1質(zhì)粒購自于美國Invitrogen公司。人肺癌細胞株(A549，H460)系本實驗室保存，37 ℃、5%CO2完全飽和濕度下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640中。Western blot試驗試劑與Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于日本Takara公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000與質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自美國Promega公司。

1.2pcDNA3.1(+)-EDAG-1表達載體的構建

將EDAG-1基因片段連接至真核表達載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，使用100 mg/L氨芐青霉素篩選出兩種以上陽性克隆，選取幾個克隆經(jīng)PCR和EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切檢測陽性菌落，并小量制備質(zhì)粒，進行DNA測序。

1.3pcDNA3.1(+)-EDAG-1表達載體的轉(zhuǎn)染及鑒定

常規(guī)培養(yǎng)A549和H460肺癌細胞系，取對數(shù)生長期細胞重懸，以1.0×106-2.5×106個分別接種至60 mm 96孔板中。待70%-80%細胞融合后，使用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導載體(8 μg/孔)進行重組載體轉(zhuǎn)染。6-8 h后換液，連續(xù)培養(yǎng)24 h，10倍稀釋細胞后施加篩選壓力，改用含G418培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換1次培養(yǎng)液，14 d后挑選并保存單克隆細胞。將轉(zhuǎn)染成功的細胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)液中。

1.4Western blot檢測EDAG-1蛋白表達水平

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個，預冷PBS沖洗2次后加入400 μl RIPA(臨用前加入PMSF以抑制蛋白酶肽)于冰上裂解細胞30 min，4 ℃ 12 000×g離心30 min，移取上清液定量后進行SDS-PAGE電泳。目標條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的1×TBS-T 4 ℃封閉過夜，一抗(C末端單抗)按1∶2 000反應60 min，TBS-T沖洗4次；二抗按1∶2 000反應60 min，TBS-T沖洗4次后顯影。

1.5Real-time PCR檢測EDAG-1 mRNA表達

按照Trizol使用說明書提取A549和H460細胞系的總RNA，使用紫外分光光度計測定其濃度。然后按照Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA加入到Taqman MicroRNA real-time PCR試劑盒中，在RT-PCR儀上進行定量。采用2-ΔΔCt方法分析EDAG-1在不同細胞中的相對表達水平。

1.6MTT檢測細胞增殖

取轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染EDAG-1的肺癌細胞系)及對照組(轉(zhuǎn)染空載體的肺癌細胞系)細胞，以2×103個/孔接種于96孔板后加入無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。每天檢測細胞含量。待穩(wěn)定后，每孔先加入10 μl(5 g/L)的MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，然后換液，每孔加入150 μl二甲亞砜，放入搖床中輕微振蕩直至MTT完全溶解并轉(zhuǎn)化生成紫色甲臜。用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度。

1.7細胞凋亡的檢測

取轉(zhuǎn)染組及對照組細胞用于實驗。嚴格按照Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞(2×105個)加入到100 μl 1×Binding緩沖液重懸，添加2.5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI染料，振蕩混勻，暗處放置10 min，然后用流式細胞儀進行檢測，計算凋亡細胞數(shù)量。應用Western blot檢測凋亡蛋白caspase-3和Bcl-2的表達情況，實驗方法同1.4。

1.8統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用配對樣品t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1pcDNA3.1(+)-EDAG-1載體的轉(zhuǎn)染與鑒定

將構建載體分別進行PCR和酶切驗證，結果顯示，產(chǎn)物大小與合成EDAG-1片段一致(見圖1)。上述結果表明，EDAG-1真核載體已成功構建。

M.Marker；1.pcDNA3.1(+)-EDAG-1載體PCR產(chǎn)物，大小約為1 492 bp；2.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切空載體pcDNA3.1；3.9EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EDAG -EDAG-1圖1　pcDNA3.1(+)-EDAG-1 PCR與酶切結果Figure 1　PCR and enzyme digestion results of pcDNA3.1(+)-EDAG-1

2.2EDAG-1的mRNA表達

將轉(zhuǎn)染組用Real-time PCR檢測其mRNA表達情況。結果表明，A549轉(zhuǎn)染組細胞中EDAG-1的mRNA表達水平較A549對照組明顯增高；H460轉(zhuǎn)染組的EDAG-1的mRNA表達水平較H460對照組亦明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2)。

2.3EDAG-1的蛋白表達

與EDAG-1mRNA表達結果相一致，A549轉(zhuǎn)染組及H460轉(zhuǎn)染組細胞中的EDAG-1蛋白表達水平分別較其對照組有明顯升高(β-actin為內(nèi)參，見圖3)。

1.A549對照組；2.A549轉(zhuǎn)染組；3.H460對照組；4.H460轉(zhuǎn)染組與其相應對照組比較，**P<0.01圖2　qRT-PCR檢測EDAG-1的mRNA表達Figure 2　Expression of EDAG-1 mRNA after transfection by qRT-PCR

1.A549對照組;2.A549轉(zhuǎn)染組;3.H460對照組;4.H460轉(zhuǎn)染組圖3　Western blot檢測EDAG-1的蛋白表達Figure 3　Protein expression of EDAG-1 after transfection by Western blot

2.4過表達EDAG-1對肺癌細胞增殖的影響

將A549及H460轉(zhuǎn)染組與A549及H460對照組細胞在相同條件下培養(yǎng)96 h，采用MTT法測定生長曲線(λ=490 nm)。實驗結果表明，72 h和96 h時轉(zhuǎn)染組較對照組的細胞增殖速度明顯減慢，具有顯著性差異(P<0.01，見圖4)，即轉(zhuǎn)染EDAG-1可以抑制肺癌細胞的增殖。

A.A549細胞　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.H460細胞　與其相應對照組比較，**P<0.01圖4　EDAG-1對肺癌細胞增殖的影響Figure 4　Effects of EDAG-1 on proliferation of lung cancer cell line

2.5過表達EDAG-1對肺癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果表明，A549及H460轉(zhuǎn)染組肺癌細胞的凋亡率明顯高于其相應對照組(P<0.01，見圖5)。與其相應對照組比較，轉(zhuǎn)染組的caspase-3表達量較高，而Bcl-2的表達量較低(β-actin為內(nèi)參，見圖6)，這與流式細胞儀檢測結果相一致，表明高表達EDAG-1促進肺癌細胞的凋亡。

1.A549對照組； 2.A549轉(zhuǎn)染組； 3.H460對照組； 4.H460轉(zhuǎn)染組與其相應對照組比較，**P<0.01圖5　EDAG-1對肺癌細胞凋亡的影響Figure 5　Effect of EDAG-1 on the apoptosis of lung cancer cell line

1.A549對照組；2.A549轉(zhuǎn)染組；3.H460對照組；4.H460轉(zhuǎn)染組圖6　EDAG-1對肺癌細胞相關凋亡蛋白的影響Figure 6　Effect of EDAG-1 on the apoptosis-related protein expression of lung cancer cells

3討論

EDAG-1是一種與細胞增殖、分化調(diào)控相關的新型基因。相關研究證實，該基因主要分布在人胚胎肝及骨髓等造血組織，常高表達于多種白血病細胞株及白血病患者外周血中。進而研究人員推測EDAG-1基因與細胞，特別是血液細胞，增殖、分化調(diào)控等密切相關，且該基因高表達可能與細胞維持未分化或低分化狀態(tài)相關[16]。其基因產(chǎn)物是核蛋白，可能與其他核內(nèi)因子作用后間接發(fā)揮作用[3]。Yang等[3]在解析EDAG表達蛋白的氨基酸序列時發(fā)現(xiàn)，EDAG基因內(nèi)部存在核定位信號與環(huán)繞結構域，指示與其他蛋白聚合的可能性，但具體功能與相關蛋白仍未獲知。肺癌是我國發(fā)病率較高的癌癥之一。EDAG-1在正常人肺組織中表達量極低或不表達[4]。但其在肺癌中的表達尚不明確。本研究將體外合成的EDAG-1基因亞克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)上，并通過脂質(zhì)體介導成功轉(zhuǎn)染至人肺癌細胞株中。研究表明，轉(zhuǎn)染后A549細胞和H460細胞均過表達EDAG-1；同時過表達EDAG-1可抑制肺癌細胞的增殖并促進其凋亡。

經(jīng)證實，Bcl-2蛋白是細胞凋亡抑制成分。作為Bcl-2家族中的主要成員，Bcl-2在凋亡信號傳導過程中，常作為caspase的上游調(diào)控機制[17]。多數(shù)情況下，過量表達的Bcl-2能有效抑制住各種因素所誘發(fā)的caspase激活和凋亡。Zhan等[18]報道了Bcl-2可阻止具腎毒性的順鉑誘導的腎上皮細胞caspase-3的激活與凋亡。而Bcl-2轉(zhuǎn)基因后的高表達抑制了caspase-3和caspase-6的激活和其他凋亡事件[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，EDAG-1轉(zhuǎn)染組的肺癌細胞凋亡率明顯高于對照組(轉(zhuǎn)染空載體)，且轉(zhuǎn)染組的caspase-3表達量較高，Bcl-2表達量較低，表明高表達EDAG-1可能通過Bcl-2家族及caspase-3家族促進肺癌細胞的凋亡，但其具體機制仍需進一步實驗證明。

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Effects of embryonic development associated gene-1 on the proliferation and apoptosis of human lung cancer cell lines

SHI Hongyang*, DENG Wenjing, ZHANG Yuping, ZHANG Dexin

(DepartmentofRespiratoryMedicine,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004，China;*Correspondingauthor,E-mail：shihy2003@126.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of newly-cloned embryonic development associated gene-1(EDAG-1) on proliferation and apoptosis of human lung cancer cells. MethodsThe eukaryotic expression vector, pcDNA3.1(+)-EDAG-1, was successfully constructed and stably transfected into the A549 and H460 cells by liposome method. Then the EDAG-1 mRNA and protein expression levels were determined by qRT-PCR and Western blot, respectively. At the same time, the proliferation and apoptosis of cells were detected.ResultsAfter transfection, the mRNA and protein expression levels of EDAG-1 in A549 and H460 cells were significantly increased(P<0.01). Compared with A549 and H460 cells transfected with empty vectors, the proliferation of A549 and H460 cells transfected with EDAG-1 was significantly inhibited, and the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01). ConclusionEDAG-1 can inhibit the proliferation of lung cancer cells and promote its apoptosis, which may play an important role in the occurrence of lung cancer.Key words:EDAG-1;lung cancer;gene expression;proliferation;apoptosis

[收稿日期：2015-11-13]

作者簡介：史紅陽，女，1976-07生，博士，主治醫(yī)師，E-mail:shihy2003@126.com.

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0026-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.007

基金項目：中央高校基本科研業(yè)務費專項基金資助項目(XJJ2012057)；西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院科研基金資助項目(Yj(QN)201101)