CAC1對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞周期的調(diào)控作用

鄭　琪， 張　茜， 張　彧， 廖子君， 姚　煜， 南克俊(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安　7006；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

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CAC1對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞周期的調(diào)控作用

鄭琪1， 張茜1， 張彧1， 廖子君1， 姚煜2， 南克俊2(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安710061；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

摘要：目的研究新基因CAC1對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS的細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。方法將AGS細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組，分別給予細(xì)胞培養(yǎng)液、陰性對(duì)照siRNA和有效的CAC1-siRNA處理，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因(p53、cyclin A、cyclin E及CDK2)在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果CAC1沉默后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RNA干擾組的AGS細(xì)胞G1期細(xì)胞比例[(73.23±3.04)%]較對(duì)照組[(45.33±0.82)%]明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞比例[(5.40±5.83)%]較對(duì)照組[(41.07±1.07)%]顯著減少(P<0.05)。CAC1沉默后，與對(duì)照組相比，干擾組無(wú)論是cyclin E的mRNA表達(dá)水平(1.000±0.000 vs 0.294±0.011,P<0.05)，還是cyclin A的mRNA表達(dá)水平(1.000±0.000 vs 0.886±0.039,P<0.05)，均出現(xiàn)了明顯的下降，p53 mRNA表達(dá)水平顯著上升(1.000±0.000 vs 2.233±0.122,P<0.05)，CDK2mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(1.000±0.000 vs 0.952±0.007,P>0.05)。類似地，CAC1沉默后，與對(duì)照組相比，干擾組的cyclin E蛋白表達(dá)水平(0.667±0.236 vs 0.165±0.046,P<0.05)和cyclin A蛋白表達(dá)水平(0.607±0.284 vs 0.208±0.029,P<0.05)均出現(xiàn)了明顯的下降，P53蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著的上升(0.326±0.054 vs 0.656±0.106,P<0.05)；而CDK2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(0.864±0.175 vs 0.717±0.100,P>0.05)。結(jié)論CAC1可促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換，下調(diào)p53的表達(dá)，上調(diào)cyclin E和cyclin A的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：胃癌；AGS細(xì)胞；CAC1；細(xì)胞周期

世界范圍內(nèi)每年大約有98.9萬(wàn)人新診斷為胃癌，73.8萬(wàn)人死于胃癌，胃癌的年發(fā)病人數(shù)在所有惡性腫瘤排第四位，年死亡人數(shù)排第二位，超過70%的胃癌發(fā)病和死亡患者都屬于發(fā)展中國(guó)家[1]。晚期轉(zhuǎn)移性的胃癌患者預(yù)后不良，中位生存期僅僅8-10個(gè)月，5年生存率不足7%[2]。胃癌具有相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率，有必要深入地研究其病因和發(fā)病機(jī)制，以提高診斷和治療水平。

CDK-associated cullin 1 (CAC1)是2009年在結(jié)直腸癌中鑒定發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，研究發(fā)現(xiàn)，CAC1可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖，推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換，它能夠特異性地和CDK2結(jié)合并提高其活性[3]。而且，CAC1在阿爾茨海默病患者的腦組織呈現(xiàn)低表達(dá)，并抑制氧化應(yīng)激損傷所致的細(xì)胞凋亡[4]。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，大腸癌中去氧膽酸通過下調(diào)miR-199a-5p來增加CAC1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和耐藥[5]。乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CAC1可與HDAC協(xié)同下調(diào)RARα的活性[6]，還可以作用于組蛋白脫甲基酶LSD1，從而下調(diào)ERα[7]。肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，CAC1通過激活肺癌A549細(xì)胞中的ERK1/2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[8]。

本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CAC1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于胃黏膜細(xì)胞，它還能促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]，但它對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響和其機(jī)制仍需要深入研究。因此，本文通過RNA干擾法沉默胃癌AGS細(xì)胞系中CAC1的表達(dá)，觀察細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的變化，分析和探討CAC1對(duì)胃癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

高表達(dá)CAC1基因的人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS[9]購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，碘化丙啶(PI)購(gòu)自美國(guó)sigma公司，Rnase購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CDK2鼠單克隆抗體、Cyclin A鼠單克隆抗體、Cyclin E鼠單克隆抗體、p53鼠單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。10%新生小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，胰蛋白酶購(gòu)自寶信生物，EDTA購(gòu)自北京鼎國(guó)公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitogen公司。

1.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CAC1-siRNA入AGS細(xì)胞

CAC1的siRNA干擾序列和陰性對(duì)照siRNA序列(negative control siRNA,NC-siRNA)，由上海GenePharma公司化學(xué)合成，具體序列如下。siRNA sense：5′-GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT-3′，siRNA antisense：5′-UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG-3′，NC-siRNA sense：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，NC-siRNA antisense：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。實(shí)驗(yàn)組為siRNA組和NC-siRNA組，將兩種RNA干擾序列與不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，設(shè)置平行孔和對(duì)照組，對(duì)照組為胃癌AGS細(xì)胞(cell)組和單加脂質(zhì)體(lipo)組。轉(zhuǎn)染前將脂質(zhì)體與相應(yīng)劑量的無(wú)血清培養(yǎng)液混合，室溫下孵育5-30 min。將脂質(zhì)體與siRNA的混合液加入培養(yǎng)板，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后移去轉(zhuǎn)染試劑，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞，加入60 nmol/L的CAC1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染完成后，加入100 μg/ml的 PI染液100 μl，最后進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞在488 nm處被氬激光激發(fā)，PI的紅色熒光通過630 nm濾光片收集，結(jié)果用美國(guó)B-D FACSort Cell Quest軟件做DNA分析。

1.4real-time PCR法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

實(shí)驗(yàn)分組依次為Control組、NC-siRNA組和siRNA組，siRNA轉(zhuǎn)染濃度為前期研究中的有效抑制濃度60 nmol/L[9]。引物序列由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，具體如下。CDK2 forward：5′-TTC TGC CAT TCT CAT CGG-3′；CDK2 reverse：5′-ATG GGT GTA AGT ACG AAC AGG-3′；Cyclin A forward：5′-TCC AAG AGG ACC AGG AGA ATA TCA-3′,Cyclin A reverse：5′-TCC TCA TGG TAG TCT GGT ACT TCA-3′;Cyclin E forward：5′-CCT GTA CTG AGC TGG GCA AAT AGA-3′,Cyclin E reverse：5′-ACG AAG GTC CTG ACA CGT CAC GTA-3′；p53 forward：5′-CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3′；p53 reverse：5′- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3′；β-actin forward：5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′；β-actin reverse：5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)水平。

1.5Western blot法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

提取細(xì)胞總蛋白，制備蛋白電泳樣品，丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜蛋白遷移，將膜放入一個(gè)可以封口的塑料雜交袋中，依次加入稀釋的一抗和二抗。將膜放入玻璃皿中，加入已配好的化學(xué)發(fā)光底物，置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。結(jié)果應(yīng)用美國(guó)Image J軟件分析，計(jì)算每個(gè)條帶的積分光密度(OD)值，進(jìn)行半定量分析。采用各目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度比值(targeted protein/β-actin)來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1CAC1沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀分析了對(duì)照組、NC-siRNA組和siRNA組AGS細(xì)胞周期(見圖1)。與對(duì)照組[(45.33±0.82)%]相比，siRNA組G1期細(xì)胞比例[(73.23±3.04)%]明顯增加(P<0.05)，而S期細(xì)胞比例顯著下降[(5.40±5.83)%vs(41.07±1.07)%,P<0.05)]，G2期細(xì)胞比例較對(duì)照組輕度上升，但其變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(21.37±2.88)%vs(13.61±0.46)%,P>0.05]。NC-siRNA組各期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比，其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　CAC1沉默后細(xì)胞周期的變化(與對(duì)照組比較，*P<0.05)Figure 1　Changes of cell cycle after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

2.2CAC1沉默對(duì)周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

從實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果可以看出，CAC1沉默組(siRNA組)與對(duì)照組(control group)相比，無(wú)論是cyclin E mRNA水平，還是cyclin A mRNA水平，均出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)；p53 mRNA表達(dá)水平在CAC1沉默后則發(fā)生了顯著的上升(P<0.05)；CDK2的mRNA表達(dá)水平在CAC1沉默前后的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，陰性對(duì)照組(negative control group, NC-siRNA group)的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(P>0.05，見圖2，表1)。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞中各細(xì)胞周期相關(guān)基因在蛋白水平的變化趨勢(shì)與mRNA水平變化趨勢(shì)基本一致。與對(duì)照組相比，CAC1沉默后，cyclin E蛋白表達(dá)水平和cyclin A蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)了明顯的下降(P<0.05)；P53蛋白表達(dá)水平則出現(xiàn)了顯著的上升(P<0.05)；而CDK2蛋白表達(dá)水平在CAC1沉默前后的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，陰性對(duì)照組(NC-siRNA group)的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(P>0.05，見圖3，表2)。

圖2　CAC1沉默后細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)(與對(duì)照組比較，*P<0.05)Figure 2　The mRNA expressions of cell cycle-related genes after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

表1CAC1沉默后凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化

Table 1Changes of apoptosis-associated genes expression at mRNA level after CAC1 silencing

組別 p53cyclinEcyclinACDK2CAC1沉默組2.233±0.1220.294±0.0110.886±0.0390.952±0.007對(duì)照組1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000P0.0000.0000.0100.925

A.CAC1沉默后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白印跡圖　　　　　　B.CAC1沉默后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白定量分析圖圖3　CAC1沉默后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)變化(與對(duì)照組比較，*P<0.05)Figure 3　Expression of cell cycle-related proteins after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

表2CAC1沉默后細(xì)胞周期相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的變化

Table 2Changes of cell cycle-associated genes expression at protein level after CAC1 silencing

組別P53CyclinECyclinACDK2CAC1沉默組0.656±0.1060.165±0.0460.208±0.0290.717±0.100對(duì)照組0.326±0.0540.667±0.2360.607±0.2840.864±0.175P0.0060.0320.0410.207

3討論

CAC1是在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，它定位于人類第10號(hào)染色體的10q25-q26，翻譯的蛋白由369個(gè)氨基酸組成，在其137-250位氨基酸之間包含有一個(gè)cullin樣的功能域，故被歸類為cullin家族成員[3]。結(jié)直腸癌中的研究顯示，CAC1在腫瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平高于相應(yīng)的正常細(xì)胞和組織；CAC1的表達(dá)與患者年齡、腫瘤部位及轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與結(jié)直腸癌的病理類型及臨床分期有關(guān)；CAC1可調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[3]。但有關(guān)它在胃癌組織和細(xì)胞中的功能研究較少。本課題組前期的研究提示，CAC1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于胃黏膜細(xì)胞，并能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。

細(xì)胞的增殖依賴于高效有序的細(xì)胞周期，CAC1在胃癌AGS細(xì)胞系中表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，提示它可能直接或間接影響了細(xì)胞周期的進(jìn)程。細(xì)胞周期是指每一次有絲分裂的結(jié)束到下一次有絲分裂的結(jié)束。完整的細(xì)胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。細(xì)胞周期啟動(dòng)的主要調(diào)控點(diǎn)在G1期，特別是在G1晚期存在一個(gè)限制點(diǎn)(restriction point)，一旦通過該限制點(diǎn)，細(xì)胞就能依次完成剩下的G1、S、G2、M期，而不依賴于生長(zhǎng)因子的持續(xù)刺激。如果細(xì)胞在G1期缺乏相應(yīng)生長(zhǎng)因子，則細(xì)胞周期將停止在限制點(diǎn)，細(xì)胞進(jìn)入“安靜”狀態(tài)，稱為G0期。S期細(xì)胞所占比例大小，可以表明開始新一輪DNA復(fù)制合成和分裂的細(xì)胞數(shù)量的多少。

通過流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)，CAC1沉默后，AGS細(xì)胞G1/G0期比例增加了約28%，而S期細(xì)胞比例下降了約36%，G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，即細(xì)胞周期在G1期發(fā)生阻滯。這與此前在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[3]，這說明CAC1在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)AGS細(xì)胞通過G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞周期演進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心是一組蛋白激酶在細(xì)胞周期內(nèi)特定時(shí)相激活，通過對(duì)相應(yīng)的底物磷酸化來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞完成細(xì)胞周期。這些蛋白激酶的細(xì)胞周期特異性激活，依賴于一類細(xì)胞周期特異性表達(dá)、累積和降解的蛋白質(zhì)即細(xì)胞周期素(cyclins)，故而前者被稱為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)。目前人類細(xì)胞主要的cyclins有8類共11種[10,11]；主要的CDK有CDK1、CDK2、CDK4和CDK6。Cyclins與相應(yīng)的CDKs結(jié)合后，二者形成的功能復(fù)合體才能使細(xì)胞周期有序進(jìn)行。一般而言，CDK4、CDK6與cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3的結(jié)合是G1期運(yùn)行的必要條件；CDK2與cyclin E的結(jié)合是S期啟動(dòng)的必要條件；CDK2還可以與cyclin A的結(jié)合，是G2期啟動(dòng)和進(jìn)行的必要條件；CDK1與cyclin B1的結(jié)合對(duì)M期啟動(dòng)和進(jìn)行是必需的條件[12]。

研究中檢測(cè)了與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)系密切的cyclin E、cyclin A和CDK2的變化。cyclin E的mRNA和蛋白表達(dá)水平在CAC1沉默后出現(xiàn)了明顯的下降。同時(shí)，CDK2的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化。故CAC1可能對(duì)cyclin E的表達(dá)具有上調(diào)作用，而對(duì)CDK2的表達(dá)無(wú)明顯影響。

實(shí)驗(yàn)中CAC1的沉默引起了cyclin E表達(dá)水平的明顯下降，提示CAC1可能促進(jìn)cyclin E的表達(dá)。另外，對(duì)HeLa細(xì)胞的研究中觀察到，CAC1水平從G0期開始逐漸上升，至S期表達(dá)水平達(dá)到高峰，S中期開始下降，至S/G2期又再次升高，到達(dá)G0期后表達(dá)最低；其表達(dá)定位也隨著細(xì)胞周期的變化而改變，G0、M期主要定位在細(xì)胞質(zhì)，S期主要定位于細(xì)胞核；同時(shí)，cyclin E的表達(dá)從G1中期開始升高，至G1/S交界處達(dá)高峰，細(xì)胞進(jìn)入S期后，cyclin E開始下降，到G2/M期降為零[3]。可見，CAC1的下調(diào)引起cyclin E的下調(diào)，且CAC1與cyclin E在G1/S期表達(dá)最高的峰值存在重疊，CAC1很可能直接或間接上調(diào)cyclin E的表達(dá)。

免疫共沉淀法已經(jīng)證實(shí)，CAC1能夠與CDK2結(jié)合并提高CDK2的活性，但不影響CDK2的表達(dá)量[3]。本研究也證實(shí)了CDK2無(wú)論在mRNA水平還是在蛋白水平，其表達(dá)不受CAC1表達(dá)變化的影響。CAC1一方面可以上調(diào)cyclin E的表達(dá)，另一方面還能增加CDK2的活性。由于cyclin E/CDK2復(fù)合體的形成對(duì)細(xì)胞跨過G1期進(jìn)入S期是必需的限速步驟之一[13]，所以，CAC1可能通過增加cyclin E/CDK2復(fù)合體的數(shù)量或活性來促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)變。

CAC1沉默后cyclin A的mRNA和蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了一定程度的下降，但其下降幅度遠(yuǎn)低于cyclin E。Cyclin A表達(dá)升高一般發(fā)生于G1/S期轉(zhuǎn)變期，并持續(xù)整個(gè)S期；它與CDK2結(jié)合，使DNA持續(xù)合成；在S期后期，它與CDK1發(fā)生聯(lián)系[13]。cyclin A與CDK2的結(jié)合是G2期啟動(dòng)和進(jìn)行的必需條件，CAC1沉默所帶來的二者表達(dá)或活性的下降可能使細(xì)胞阻滯于S期，但本研究中未發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞阻滯和G2期細(xì)胞比例的下降。可能是CAC1沉默對(duì)cyclin E/CDK2的負(fù)向調(diào)節(jié)作用大大超過了對(duì)cyclin A/CDK2的下調(diào)作用，故在AGS細(xì)胞中僅表現(xiàn)為cyclin A表達(dá)水平的下調(diào)，未出現(xiàn)S期阻滯。

有趣的是，CAC1對(duì)抑癌基因p53的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。無(wú)論是mRNA還是蛋白質(zhì)的表達(dá)量，P53在CAC1沉默后都出現(xiàn)了明顯的增加。這些結(jié)果提示，AGS細(xì)胞在CAC1沉默后出現(xiàn)了G1期阻滯，不但與cyclin E的下調(diào)和CDK2活性的下降有關(guān)，而且可能與P53的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。P53對(duì)于細(xì)胞基因組完整性的維持具有重要作用。文獻(xiàn)指出，P53對(duì)細(xì)胞周期的影響主要體現(xiàn)在它增加其靶基因p21的轉(zhuǎn)錄，而P21蛋白是多種CDK抑制劑(CDK2,CDK4,CDK6)。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，P53還可以通過抑制激酶的活性來阻礙Rb的磷酸化，結(jié)果使細(xì)胞停滯于G1期進(jìn)行DNA修復(fù)；如果DNA損傷程度超過了細(xì)胞修復(fù)能力，P53可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。而且，野生型的P53還可以抑制cyclin A的表達(dá)[14]。

CAC1是如何引起cyclin E、cyclin A和p53等基因表達(dá)改變的，其具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。首先，文獻(xiàn)報(bào)道，CDK2活性的抑制可導(dǎo)致ATM-和ATR-依賴的P53第15位serine上發(fā)生磷酸化，從而引起P53和P21蛋白表達(dá)的明顯升高[15]，CAC1的表達(dá)下調(diào)可引起CDK2活性下降，從而造成P53水平上升。其次，P53已經(jīng)證實(shí)對(duì)cyclin A的表達(dá)具有抑制作用，故CAC1沉默引起的P53上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致cyclin A表達(dá)下降。最后，cyclin E是E2F的靶基因之一，它的啟動(dòng)子上游有E2F的結(jié)合位點(diǎn)[13]；CAC1可能通過直接過間接的方式使Rb磷酸化，Rb磷酸化水平增高可引起E2F釋放并作用于包括cyclin E在內(nèi)的下游靶基因[13]，進(jìn)而增加cyclin E的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

綜上所述，CAC1可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而加快分裂增殖。另外，CAC1沉默后，AGS細(xì)胞中cyclin E、cyclin A和P53的表達(dá)均在mRNA水平上發(fā)生了明顯的變化，故CAC1對(duì)上述基因的調(diào)控可能是轉(zhuǎn)錄前調(diào)控。

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Exploration on the role of CAC1 in the regulation of cell cycle of AGS gastric cancer cell line

ZHENG Qi1, ZHANG Qian1, ZHANG Yu1, LIAO Zijun1, YAO Yu2, NAN Kejun2

(1FirstDepartmentofMedicalOncology,AffiliatedShaanxiProvincialCancerHospital,CollegeofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofMedicalOncology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity)

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of novel gene CAC1 in regulating cell cycle and cell cycle-related genes expression of gastric cancer cell line AGS.MethodsAGS cells were divided into blank control group, negative control group and RNA interference group, which were treated with cell culture fluid, negative control siRNA and effective CAC1-siRNA, respectively. The cell cycle changes were analyzed by flow cytometry, and the expression of cell cycle-related genes(p53, cyclin A, cyclin E and CDK2) at mRNA and protein levels were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. ResultsAfter CAC1 expression was effectively silenced by RNA interference in AGS cells, the cell proportion in G1 phase[(73.23±3.04)%] increased remarkably compared with control group[(45.33±0.82)%,P<0.05)], and the cell proportion in S phase decreased significantly[(5.40±5.83)% vs (41.07±1.07)%,P<0.05]. In addition, both cyclin E mRNA expression(0.294±0.011 vs 1.000±0.000,P<0.05) and cyclin A mRNA expression (0.886±0.039 vs 1.000±0.000,P<0.05) were significantly down-regulated after CAC1 silencing, p53 mRNA expression increased significantly (2.233±0.122 vs 1.000±0.000,P<0.05), and CDK2 mRNA expression had no significant change(0.952±0.007 vs 1.000±0.000,P>0.05). Likewise, both cyclin E protein expression(0.165±0.046 vs 0.667±0.236,P<0.05) and cyclin A protein expression(0.208±0.029 vs 0.607±0.284,P<0.05) were dramatically down-regulated after CAC1 silencing,P53 protein expression increased(0.656±0.106 vs 0.326±0.054,P<0.05), and CDK2 protein expression had no significant change(0.717±0.100 vs 0.864±0.175,P>0.05).ConclusionCAC1 can promote G1/S transition, down-regulate P53 expression and up-regulate cyclin E and cyclin A expression in AGS gastric cancer cell line.

Key words:gastric cancer;AGS cells;CAC1;cell cycle

[收稿日期：2015-08-28]

作者簡(jiǎn)介：鄭琪，男， 1979-03生，博士，主治醫(yī)師E-mail：snowpinezq@163.com.

中圖分類號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)01-0035-06

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.009