敲低和過表達LDHB對HeLa細胞生長的影響

金科華， 劉復興(湖北科技學院基礎醫學院生物化學教研室， 咸寧　43700； 湖北科技學院基本醫學院病理學教研室)

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敲低和過表達LDHB對HeLa細胞生長的影響

金科華1， 劉復興2(1湖北科技學院基礎醫學院生物化學教研室， 咸寧437100；2湖北科技學院基本醫學院病理學教研室)

摘要：目的研究敲低和過表達LDHB(lactate dehydrogenase B)對HeLa細胞生長的影響。方法根據慢病毒質粒pLn (pLL3.7-neo) 特點，設計三對分別靶向LDHB cDNA 48,201,443位核苷酸序列的shRNA(short hairpin RNA)引物，退火后與pLn重組。同時，將LDHB cDNA與慢病毒質粒pIp(pBOBI-IRES-puro)重組，獲得的重組質粒與慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞，將獲得的病毒上清感染HeLa細胞，Western blot鑒定LDHB的敲低和過表達對LDHB蛋白水平的影響，并觀察其對HeLa細胞生長的影響。結果靶向LDHB第48位核苷酸的shRNA顯著敲低LDHB(P<0.01)，443位次之，201位無敲低作用。shRNA序列對HeLa細胞生長的抑制作用與其敲低效果成正相關。轉染pIp-LDHB顯著升高LDHB在HeLa細胞中的表達水平(P<0.01)，但不影響其生長。結論敲低LDHB抑制HeLa細胞生長，下調LDHB的表達可能有助于宮頸癌的治療。

關鍵詞：乳酸脫氫酶B；敲低；過表達；HeLa細胞

近年來，陸續發現乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenase B,LDHB)的異常表達與腫瘤的發生、發展和不良預后密切相關。von Eyben等[1],康一娟[2],張惟[3]分別發現睪丸癌、子宮內膜異位癌和膀胱移行細胞癌中LDHB高表達。Ishikawa等[4]研究表明生殖細胞瘤中因LDHA(lactate dehydrogenase A)的高度甲基化，導致LDHB高度表達，而Leiblich等[5]發現前列腺癌細胞中LDHB啟動子高度甲基化，導致其表達沉默。Liao等[6]發現LDHB低表達與膀胱尿路上皮癌的發展密切相關。駱平等[7]和McCleland等[8]發現敲低LDHB可以抑制肝癌細胞和三陰性乳腺癌細胞的生長，而Cui等[9]發現抑制LDHB可誘導胰腺癌的糖酵解表型并促進其生長。

可見，LDHB對腫瘤細胞生長的作用具有特異性。本文采用過表達和shRNA干預LDHB的表達，觀察其對HeLa細胞生長的影響，以期發現LDHB對HeLa生長的作用，為宮頸癌的基因治療奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株、質粒、cDNA與細胞株

大腸埃希菌DH5α、TOP10，質粒pIp(pBOBI-IRES-puro)、pLn(pLL3.7-neo)分別由李博安教授、吳喬教授饋贈，慢病毒包裝質粒(MDL、VSGV、REV)及LDHB cDNA為韓家淮教授饋贈。人胚腎293T細胞、HeLa細胞為本教研室保存。

1.2主要試劑

PrimeSTAR DNA聚合酶、Solution Ⅰ、小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)為TaKaRa產品。膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒為OMEGA產品；快速限制性核酸內切酶為Thermo公司產品。胎牛血清(FBS)為PPA公司產品，DMEM培養基為Invitrogen公司產品。Polybrene為Sigma產品。 RIPA(強)裂解液，BCA法蛋白定量試劑盒為碧云天公司產品。抗人LDHB、LDHA、β-actin單克隆抗體分別為Epitomics、Cell signaling和Sigma公司產品，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(或鼠)IgG抗體(二抗)購自北京中杉金橋公司。增強型化學發光液(ECL)、Fugene轉染試劑購自Promega公司。

1.3構建LDHB干擾表達載體

1.3.1LDHB干擾引物的設計根據LDHB cDNA序列及質粒pLn說明書，利用Lifetechnology公司的iRNA在線設計軟件，設計靶向LDHB cDNA第48、201、443位核苷酸序列的 shRNA(short hairpin RNA)引物。正向引物：48 s：5′-TGGCAACAGTTCCAAACAATTTCAAGAGAATTGTTTGGAACTGTTGCCTTTTTTC-3′；201s: 5′-TGCATGGGAGCTTATTTCTTTTCAAGAGAAAGAAATAAGCTCCCATG-

CTTTTTTC-3′；443s: 5′-TCCTGGAAACTAAGTGGATTTTCAAGAGAAATCCACTTAGTTTCCAGGTTTTT-

TC-3′。反向引物：48a: 5′-TCGAGAAAAAAGGCAA

CAGTTCCAAACAATTCTCTTGAAATTGTTTGGAACT-

GTTGCCA-3′；201a: 5′-CGAGAAAAAAGCATGGGAGCTTATTTCTTTCTCTTGAAAAGAAATAAGCTCCC-

ATGCA-3′； 443a: 5′-TCGAGAAAAAACCTGGAAACTAAGTGGATTTCTCTTGAAAATCCACTTAG-

TTTCCAGGA-3′。下劃線處為發夾的loop區。正、反向引物的5′端進行磷酸化修飾。引物退火后-20 ℃保存，備用。

1.3.2 退火產物與pLn連接、轉化取pLn質粒28 μl(2 μg)，HpaⅠ、XbaⅠ各3 μl，10×FD buffer 6 μl，水20 μl，混勻，37 ℃酶切1 h。膠回收雙酶切的pLn，并對其去磷酸化：pLn 45 μl，CIAP 2 μl，10×CIAP buffer 6 μl，水7 μl，混勻，37 ℃反應1 h。用PCR純化試劑盒純化去磷酸化的pLn。將4 μl pLn、1 μl退火產物及5 μl Solution Ⅰ混勻，16 ℃連接3 h。連接產物熱激法轉化TOP10感受態細胞，于含100 μg/ml羧芐青霉素的LB平板篩選抗性菌落。

1.3.3鑒定重組干擾質粒將單菌落接種于10 ml含100 μg/ml羧芐青霉素的LB中，37 ℃，250 r/min，培養10 h。抽提質粒，進行酶切鑒定：pLn-LDHB shRNA 16 μl，HpaⅠ、XbaⅠ 各1 μl，10×FD green buffer 2 μl，混勻，37 ℃酶切2 h。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對酶切鑒定的陽性質粒進行測序。

1.4構建LDHB過表達載體

1.4.1PCR擴增LDHB根據LDHB cDNA序列及質粒pIp多克隆位點，設計正向引物LDHBs: CGATCTAGAATGGCAACTCTTAAGGAAAAACTC；反應引物LDHBa: AGTGGATCCTCACAGGTCTTTTAGGTCCTTCTG。下劃線序列分別為XbaⅠ、BamHⅠ位點。PCR體系：LDHBs(10 μmol/L)4 μl，LDHBa(10 μmol/L)4 μl，5×HS Buffer 40 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)16 μl，H2O 132 μl，PrimeSTAR DNA聚合酶 2 μl，LDHB cDNA 2 μl，混勻，分成4等份。PCR參數：98 ℃，10 s；65 ℃，10 s；72 ℃，1 min。30個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物行膠回收純化。

1.4.2PCR產物與pIp連接、轉化取pIp質粒16 μl(1 μg)，XbaⅠ、BamH Ⅰ各1 μl，10×FD Green buffer 2 μl。混勻，37 ℃酶切2 h。膠回收雙酶切的pIp。另取PCR產物20 μl，XbaⅠ、BamHⅠ 各2 μl，10×FD Green buffer 4 μl，水12 μl。混勻，37 ℃酶切1 h。PCR純化試劑盒純化酶切產物。將pIp 1 μl、酶切后純化的PCR產物4 μl及SolutionⅠ 5 μl混勻，16 ℃連接1 h。按1.3.2轉化連接產物、篩選抗性菌落。

1.4.3鑒定重組過表達質粒按1.3.3的方法抽提質粒、酶切和測序鑒定重組質粒pIp-LDHB。

1.5慢病毒的包裝與感染

將293T細胞按1.5×106個/皿接種于直徑6 cm的培養皿，加入3 ml培養基(DMEM+10% FBS)，培養過夜。將重組干擾質粒(或過表達質粒)3 μg、MDL 1.5 μg、VSVG 0.9 μg、REV 0.6 μg混合，加入0.4 ml OPTI-MEM培養基，并加入18 μl Fugene HD，混勻，室溫靜置15 min。更新293T細胞培養基，逐滴加入質粒轉染混合物，輕晃混勻。24 h后更新培養基，收集轉染后48 h的培養基，置-80 ℃保存。

將HeLa細胞按6×105個/孔接種于6孔板，加入1.5 ml培養基(同上)，培養過夜。將-80 ℃保存的含慢病毒的培養基恢復至室溫，加入終濃度10 μg/ml的polybrene，混勻。棄HeLa細胞培養基，PBS洗滌一次，加入1.5 ml上述病毒液，平行感染兩孔HeLa細胞(一孔用于Western blot檢測，另一孔用于篩選穩轉細胞)，輕晃混勻，培養8 h，更新培養基，繼續培養24 h，觀察HeLa細胞形態變化，并拍照記錄。

1.6Western blot檢測 LDHB干擾或過表達效果

棄檢測孔培養基，PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液 200 μl，冰浴裂解5 min，收集裂解的細胞，超聲10 s,4 ℃ 13 000 r/min離心10 min。取上清，測定蛋白濃度，用RIPA裂解液將其調整至等濃度，加入4×loading buffer，混勻，100 ℃ 加熱10 min。取15 μl樣品進行SDS-PAGE。電泳完畢，將蛋白轉移至PVDF膜；5% BSA室溫封閉1 h；分別加3 ml 1∶20 000稀釋的抗LDHB抗體、1∶5 000稀釋抗β-actin抗體、1∶5 000稀釋的抗LDHA抗體，于4 ℃將相應的PVDF膜孵育過夜；回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min；加20 ml 1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h；回收二抗，TBST洗膜3次，每次5 min；加1 ml ECL覆蓋PVDF膜，用BIO-RAD ChemiDOC XRS+成像系統拍照。

上述1.5-1.6的實驗，均重復三次。

2結果

2.1重組干擾質粒的鑒定

重組LDHB干擾質粒和空質粒pLn經XbaⅠ+XhoⅠ 酶切后，均于250-500 bp之間出現小片段，且重組質粒酶切產生的小片段比空質粒大，與預期相符(圖1)。可見LDHB干擾引物退火片段成功插入pLn中。測序結果表明插入片段序列均與理論一致。

M.DNA marker；CK.pLn Xba Ⅰ+XhoⅠ酶切產物；1.pLn-LDHB sh48 Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產物； 2.pLn-LDHB 201 Xba Ⅰ+XhoⅠ酶切產物; 3.pLn-LDHB 443 XbaⅠ+XhoⅠ酶切產物圖1　重組干擾質粒的酶切鑒定Figure 1　Identification of recombinant interfering plasmids by digestion

2.2LDHB cDNA PCR擴增

LDHB cDNA PCR產物略大于1 000 bp，與LDHB cDNA分子量(1 005 bp)相符，而空白對照未見擴增條帶(圖2)。

M.DNA marker；1.LDHB PCR 產物；2.空白對照圖2　瓊脂糖凝膠電泳檢測LDHB cDNA PCR產物Figure 2　PCR product of LDHB cDNA by agarose gel electrophoresis

2.3重組過表達質粒的鑒定

有兩個重組子質粒酶切后產生略大于1 000 bp的條帶(6、7泳道)，與LDHB cDNA分子量(1 005 bp)相符，而空載體無此條帶(見圖3)，可見PCR產物插入pIp中。測序結果表明插入片段與LDHB cDNA序列一致。

M.DNA marker；1.pLn Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產物；2-9.重組子Xba Ⅰ+Xho Ⅰ酶切產物圖3　重組過表達質粒的酶切鑒定 Figure 3　Identification of recombinant overexpression plasmids by digestion

2.4LDHB干擾及過表達效果檢測

Western blot結果提示：48 shRNA顯著干擾LDHB的表達(P<0.01)，443 shRNA干擾作用較弱，201 shRNA、pLn、pLn-scramble均無干擾作用，且上述5個質粒對LDHA均無干擾作用(見圖4A)；pIp-LDHB顯著升高HeLa細胞LDHB的表達水平(P<0.01)，而pIp對LDHB的表達無明顯影響(見圖4B)。

圖4　Western blot檢測LDHB敲低或過表達48 h后的蛋白水平Figure 4　Protein levels of LDHB in HeLa cells at 48 h after knocking down or overexpression by Western blot

2.5干預LDHB表達對HeLa細胞生長的影響

48 shRNA干擾LDHB表達的HeLa細胞生長變慢，密度變小，漂浮細胞多；443 shRNA有類似效果，但較弱。pLn、scramble序列及201 shRNA對HeLa 細胞的生長無明顯影響(見圖5)。可見，干擾LDHB抑制HeLa細胞的生長。

感染含pIp或pIp-LDHB質粒的慢病毒的HeLa細胞與HeLa母細胞生長密度和形態無明顯差異(見圖6)。可見，過表達LDHB對HeLa細胞的生長無影響。

A.HeLa 細胞；B.感染含pLn的慢病毒的HeLa細胞; C.感染含pLn-scramble的慢病毒的HeLa細胞; D.感染含pLn-48shRNA的慢病毒的HeLa細胞;E.感染含pLn-201shRNA的慢病毒的HeLa細胞; F.感染含pLn-443shRNA的慢病毒的HeLa細胞圖5　敲低LDHB抑制HeLa細胞生長 (×10)Figure 5　Knocking down LDHB inhibited the growth of HeLa cells (×10)

A.HeLa 細胞；B.感染含pIp的慢病毒的HeLa細胞; C.感染含質粒pIp-LDHB的慢病毒的HeLa細胞圖6　過表達LDHB不影響HeLa細胞生長 (×10)Figure 6　Overexpressing LDHB had no effect on the growth of HeLa cells (×10)

3討論

正常細胞主要依靠氧化磷酸化產生ATP，而多數腫瘤細胞，即使氧氣充足，也主要由糖酵解提供ATP。同時，糖酵解中間產物為腫瘤細胞快速增殖提供生物合成前體[10]。LDH是糖酵解的重要酶之一，催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉化。LDH是由LDHA和LDHB兩種亞基構成的四聚體，共有5種同工酶(LDH1-5)，單亞基和四聚體均具有酶活性。LDHA主要催化丙酮酸還原為乳酸，而LDHB主要催化乳酸氧化為丙酮酸[11]。

理論上，LDHA表達水平不變時，干擾LDHB表達會導致LDH的同工酶LDH1、LDH2的減少，LDH5、LDH4相對增多，減少乳酸向丙酮酸的轉化，增加其逆反應，加速糖酵解，促進糖酵解表型的腫瘤細胞生長。腫瘤細胞內產生的乳酸如不及時排出胞外，會導致pH降低，引起細胞酸化中毒，抑制其生長。為防止細胞酸化，腫瘤細胞間形成代謝共生體：糖酵解表型的腫瘤細胞高表達MCT4(monocarboxylate transporter 4)，將乳酸排出胞外[12]；氧化磷酸化表型的腫瘤細胞高表達MCT1(monocarboxylate transporter 1)，攝入糖酵解表型的腫瘤細胞外排的乳酸[13]，將其氧化為丙酮酸，經由三羧酸循環氧化，產生ATP。干擾LDHB是否加速了乳酸產生，而未增加MCT4和MCT1的表達，導致胞內乳酸堆積、細胞酸化，從而抑制HeLa細胞生長，須進一步研究。LDHB是一種多功能蛋白，除催化乳酸與丙酮酸的相互轉化外，還能轉運至細胞核，調節相關基因的表達[14]。干擾LDHB的表達是否削弱LDHB的非糖酵解功能，通過其他途徑抑制HeLa細胞生長，值得深入研究。

LDHB與LDHA的cDNA序列有較高同源性[15]，但本研究結果提示LDHB的shRNA序列并未干擾LDHA的表達。故干擾LDHB對HeLa細胞生長的抑制作用與LDHA無關。

過表達是研究基因功能的常用技術，但細胞內過表達的蛋白是否具有相應的生物學活性鮮有文獻報道。過表達LDHB并未影響HeLa細胞生長，是否因LDHB缺乏翻譯后加工修飾，致其無活性，從而對HeLa細胞生長無影響，需要進一步研究。

本文結果表明敲低LDHB的表達抑制HeLa細胞的生長，可見下調LDHB的表達可能有助于宮頸癌的治療。

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Effects of knocking down and overexpression of LDHB on the growth of HeLa cells

JIN Kehua1，LIU Fuxing2

(1DepartmentofBiochemistry,BasicMedicalCollogeofHubeiScienceandTechnologyUniversity,Xianning437100,China;2DepartmentofPathology,BasicMedicalCollegeofHubeiScienceandTechnologyUniversity)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of knocking down and overexpression of LDHB on the growth of HeLa cells.MethodsThree pairs of interfering primers, respectively targeting 48, 201, 443 locus of LDHB cDNA sequences, were synthesized according to the instructions of lentivirus vector pLn(pLL3.7-neo). The cDNA of LDHB was recombined with overexpression plasmid pIp (pBOBI-IRES-puro). Recombinant plasmids pIp-LDHB or pLn-LDHB shRNAs were cotransfected with lentivirus package plasmids to 293T cells. After 48 h, the medium of 293T was harvested and applied to infect HeLa cells. The effects of interference and overexpression on the protein levels of LDHB were detected by Western blot, and the effects on the HeLa cell growth were observed simultaneously.ResultsThe protein levels of LDHB were significantly, weakly, little knocked down by shRNA 48(P<0.01), shRNA 443, shRNA 201, respectively. The protein level of LDHB was elevated significantly after transfected with pIp-LDHB(P<0.01). The inhibition effects of LDHB shRNAs on the growth of HeLa cells were in line with their interfering effects.However, the overexpression of LDHB had no influence on HeLa cell growth.ConclusionKnocking down LDHB could inhibit the growth of Hela cells, and the down-regulation of LDHB expression may contribute to the treatment of cervical cancer.

Key words:lactate dehydrogenase B;knocking down;overexpression;HeLa cells

[收稿日期：2015-08-02]

作者簡介：金科華，男，1978-12生，碩士，講師，E-mail：wenyuanxueyuan@126.com.

中圖分類號：R329

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0041-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.010

基金項目：湖北科技學院校級科研基金資助項目(ky2014074)