溶藻弧菌感染小鼠導致的炎性因子變化*

武　靜，劉曉斐，宗玉龍，曹　源， 胡成進

(濟南軍區總醫院實驗診斷科,山東濟南 250031)

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·論著·

溶藻弧菌感染小鼠導致的炎性因子變化*

武靜，劉曉斐#，宗玉龍，曹源， 胡成進△

(濟南軍區總醫院實驗診斷科,山東濟南 250031)

摘要:目的探討溶藻弧菌感染小鼠后引起的炎性因子水平變化及意義。方法建立溶藻弧菌ATCC17749T腹腔注射感染BALB/c小鼠動物模型，進行血液學和肝功能指標檢測以及肝臟病理學檢查，采用炎性因子抗體芯片進行炎性因子檢測。結果溶藻弧菌ATCC17749T感染BALB/c小鼠的半數致死量為1×109 CFU。感染組小鼠血液白細胞和血小板數目均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；紅細胞和血紅蛋白量、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；病理學觀察發現，溶藻弧菌感染可引起小鼠肝、肺嚴重損傷；炎性因子檢測篩選出20種顯著變化的炎性因子，其中細胞因子信號值大于200，倍數改變大于10的有8種炎性因子，分別為KC、IL-6、RNATES、IL-12、Eotaxin、G-CSF、MIP-1α、Mig。結論該研究所篩選出的溶藻弧菌感染小鼠后變化的炎性因子為溶藻弧菌炎癥機制的研究提供了理論依據。

關鍵詞:溶藻弧菌；動物實驗；炎性因子

溶藻弧菌是海洋弧菌科中最為常見的革蘭陰性致病菌，廣泛分布于世界各地海域和口岸處，可引起魚類發生細菌性魚病，也可引起海洋作業人員傷口海水浸泡感染、中耳炎、眼內炎、胃腸炎和敗血癥等疾病[1-3]。溶藻弧菌感染主要發生在夏季，但隨著全球變暖的趨勢，溶藻弧菌感染的季節范圍逐年擴大[4]。由于其致病特點不同于陸地致病菌，對臨床抗菌藥物的敏感性不同，而且感染后鑒定困難，不易及時救治，因此溶藻弧菌越來越受到人們關注。由于溶藻弧菌感染后均表現為局部或全身的炎性反應，具體的炎性因子變化尚不明確，因此，研究溶藻弧菌的炎性因子對于溶藻弧菌的治療和預防具有十分重要的意義。本研究建立了溶藻弧菌腹腔注射感染BALB/c小鼠動物模型，通過血液學和肝功能指標檢測，組織病理學觀察以及炎性因子檢測來探討溶藻弧菌誘導的炎性反應。

1材料與方法

1.1實驗菌株與動物本研究使用了溶藻弧菌ATCC17749T，為模式菌株，購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心。實驗動物為SPF級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質量(21±1)g，購買于山東大學動物實驗中心，適應性飼養1周。

1.2方法

1.2.1半數致死量測定根據文獻[5]中的方法，細菌在堿性蛋白胨水中過夜培養后，收集細菌懸液將其濃度調整為1×1010、5×109、1×109、5×108、1×108CFU/mL的菌懸液備用。取小鼠分為實驗組(分設5個濃度梯度)與對照組，每組10只，實驗組分別腹腔注射上述不同濃度的溶藻弧菌進行感染，每只0.1 mL；對照組注射等體積無菌堿性蛋白胨水。觀察24 h，并記錄各濃度小鼠的死亡情況。

1.2.2血液學、肝功能指標檢測溶藻弧菌致死劑量感染小鼠后，于小鼠瀕死前收集小鼠眼球血。采用Sysmex KX-21血液分析儀進行血液學檢測；剩余眼球血于5 000 r/min離心10 min，分離血清后采用貝克曼DXC800生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

1.2.3臟器組織病理學觀察收集小鼠組織臟器如心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、胃、小腸，采用甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋、切片后進行HE染色,光鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.4溶藻弧菌感染小鼠后炎性因子檢測溶藻弧菌致死劑量感染小鼠后，于小鼠瀕死前收集小鼠血清，使用RayBiotech公司小鼠炎性因子抗體芯片進行炎性因子檢測，包括干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、角質細胞起源的趨化因子(KC)、瘦素(Leptin)、脂多糖誘導的CXC趨化因子(LIX)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、MCP-5、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、單核細胞因子(Mig)、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-1γ、血小板因子-4(PF-4)、調節正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)、干擾素誘導T-細胞α亞族趨化劑(I-TAC)、T細胞活化蛋白(TCA-3)、組織源性基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、腫瘤壞死因子受體(TNFR)Ⅰ、TNFRⅡ、B淋巴細胞趨化因子(BLC)、CD30L、嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、Eotaxin-2、Fas L、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)。檢測步驟按照操作說明書進行。以細胞因子信號值大于200，倍數改變大于2或小于0.5為差異因子進行篩選。

1.3統計學處理采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理，計量資料的組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1BALB/c小鼠感染后的一般情況實驗組注射溶藻弧菌菌液2 h后開始出現毛發豎立、腹部顫抖、呼吸急促、背弓、蜷縮少動、進食減少等情況，癥狀的輕重與注射的細菌量呈正相關，死亡或活殺前上述情況都未好轉或減輕。對照組精神狀態良好，無上述癥狀，無死亡。

2.2半數致死量檢測為確定溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠的感染劑量及感染時間，本課題組進行了半數致死量實驗。根據Reed-Muench法計算得，小鼠的半數致死量為1×109CFU，本課題組的后續實驗采用劑量為每只1×109CFU。

2.3溶藻弧菌感染后小鼠主要臟器的病理改變為觀察溶藻弧菌感染對小鼠臟器的病理改變，本課題組取小鼠心、肺、肝、脾、腎、胃、小腸組織標本進行HE染色、鏡檢。腹腔注射感染溶藻弧菌后，可以引起小鼠多個臟器的損傷，以肝臟和肺臟的損傷較重，炎性反應明顯。肝細胞出現疏松、腫脹、壞死，炎癥細胞浸潤；肺臟淤血、水腫，肺泡塌陷，炎癥細胞浸潤，見圖1。

2.4溶藻弧菌感染對小鼠全血細胞分析及生化指標的影響溶藻弧菌感染組小鼠血液中白細胞和血小板水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；紅細胞和血紅蛋白水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；血清中ALT和AST水平也高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。這些檢測結果進一步驗證了肝臟炎性病理損傷，提示溶藻弧菌感染后肝功能受損。見圖2。

2.5炎性因子的芯片檢測分析本課題組收集了溶藻弧菌感染后的小鼠血清，采用炎性因子抗體芯片檢測了40種炎性因子水平的變化。以細胞因子信號值大于200，倍數改變大于2或小于0.5作為篩選條件，血清中BLC、Eotaxin、G-CSF、IL-1α、IL-6、IL-10、IL-12p40/p70、IL-17、I-TAC、KC、LIX、MCP-1、Mig、MIP-1α、RANTES、TCA-3、TIMP-1、TNF-α、sTNFRⅠ、sTNFRⅡ20種炎性因子水平增加。結果提示，溶藻弧菌感染能夠引起大量炎性因子顯著增加。其中細胞因子信號值大于200，倍數改變大于10的有8種炎性因子：KC、IL-6、RNATES、IL-12、Eotaxin、G-CSF、MIP-1α、Mig。

圖1　　　　　溶藻弧菌致小鼠肝、肺損傷的病理學

圖2　　溶藻弧菌感染小鼠后血細胞和肝功能指標檢測

3討論

大量臨床資料顯示，溶藻弧菌感染后可導致局部或全身的炎性反應，目前，具體的炎性因子尚不明確。因此，迫切需要研究溶藻弧菌感染后導致的炎性因子變化，以期為臨床診治提供一定的理論依據。

病理切片顯示，感染后肝細胞壞死，水腫，炎性細胞浸潤，并且肝功能指標ALT和AST水平也明顯升高。這些均提示感染后肝臟出現明顯炎性反應。這可能是由于細菌感染后由門靜脈進入肝臟，肝臟成為入侵的首要器官，可能更容易受損，而具體機制需要進一步探討。

根據文獻報道及本研究實驗結果，筆者推測當大量的溶藻弧菌被注入到小鼠腹腔后，溶藻弧菌被腹膜吸收后進入血液，通過血液循環到達全身各個組織臟器，引起炎性反應。為進一步探討溶藻弧菌感染小鼠的炎性反應機制，采用了炎性因子抗體芯片技術檢測小鼠血液中的炎性因子改變。本研究共檢測了40種炎性因子，篩選出20種炎性因子水平明顯增加。其中細胞因子信號值大于200，倍數改變大于10的共有8種炎性因子，分別為KC、IL-6、RNATES、IL-12、Eotaxin、G-CSF、MIP-1ɑ、Mig。

KC屬于CXC趨化因子家族，可通過與趨化因子受體2(CXCR2)結合將中性粒細胞趨化到炎癥部位發揮作用[6]。有研究報道在CXCR2缺乏小鼠的胰腺炎、肺損傷和關節炎模型中，中性粒細胞的浸潤明顯減弱[7]。IL-6是一種多功能細胞因子，可以激活巨噬細胞[8]，是造血系統、神經內分泌系統及免疫系統的主要成員[9]。在葡萄球菌感染時，IL-6過多分泌會導致小鼠的死亡[10]。在細菌性腦膜炎時，IL-6能夠增加血腦屏障的通透性，并能影響白細胞聚集及血管通透性[9]。

RNATES是促炎細胞因子趨化家族的成員[11]，對T細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞以及單核細胞具有趨化性，在白細胞向炎癥部位聚集的過程中發揮著重要作用。IL-12是一種異源二聚體細胞因子，能誘導NK細胞和T細胞產生干擾素，激活肝內外單核巨噬細胞釋放TNF等多種炎癥介質，大量的TNF作為一種炎癥介質和內毒素休克介質可導致機體出現多種免疫病理損傷，加重肝臟疾病發展[12]。

Eotaxin被認為是已發現的具有嗜酸性粒細胞趨化活性最強的趨化因子，其對嗜酸性粒細胞的作用是通過與特異性受體CCR3結合介導的。研究表明，CCR3- Eotaxin系統在過敏性炎癥(如變應性鼻炎、支氣管哮喘)的形成中起著重要作用[13-14]。G-CSF是調節粒系祖細胞增殖分化并能增強成熟粒細胞功能的細胞因子[15]。有研究者指出，G-CSF是確定細菌感染存在及其在體內繁殖與否的一項敏感指標[16]。

MIP-1ɑ屬于趨化因子家族，為巨噬細胞受到刺激后分泌的主要炎性因子[17]。MIP-1α可以活化中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞引起炎性反應，其主要作用在于調節免疫炎癥反應。趨化因子Mig又稱為CXCL9,屬于趨化因子家族，通過與其特異性G蛋白偶聯受體CXCR3的結合來發揮趨化作用。有研究報道，Mig參與了幽門螺桿菌相關性胃炎的炎細胞浸潤[18]。此外，Mig還參與了肝臟炎癥細胞的浸潤,介導了肝組織損傷,在慢性乙肝發病機制中起一定作用[19]。

溶藻弧菌感染后誘導產生多種細胞因子，這些細胞因子直接或間接參與炎性反應，以抵御溶藻弧菌的感染。而促炎細胞因子大量產生也對機體造成了病理性損傷。這些細胞因子一方面可促進炎性細胞的滲出與趨化，如KC、RNATES、Eotaxin、Mig可吸引中性粒細胞、單核-吞噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等炎性細胞遷移至炎癥病灶。另一方面可激活炎性細胞，如IL-6、IL-12、MIP-1-ɑ、Eotaxin可以激活單核-吞噬細胞、中性粒細胞等，增強它們的吞噬殺傷功能，促進他們釋放炎癥蛋白和炎癥介質，直接參與炎癥過程。

炎性因子與溶藻弧菌致病過程密切相關，它們構成了復雜的網絡，相互促進或抑制，從而在溶藻弧菌的致病過程中發揮作用。

總之，本實驗建立了溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠模型，發現溶藻弧菌感染后可以引起肝臟和肺臟的炎性損傷，發現了一些重要的炎性因子。本實驗為研究溶藻弧菌的炎癥機制提供了實驗數據,篩選出的炎性因子可能成為監測抗炎癥治療的指標。期望更多的同行能夠關注溶藻弧菌的炎癥機制研究，為溶藻弧菌的診斷、治療和預防提供新的理論依據。

參考文獻

[1]Hlady WG,Klontz KC.The epidemiology of Vibrio infections in Florida,1981-1993[J].J Infect Dis,1996,173(5):1176-1183.

[2]Morris JG,Black RE.Cholera and other vibrioses in the United States[J].N Engl J Med,1985,312(6):343-350.

[3]Ardi? N,Ozyurt M.Case report:Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Mikrobiyol Bul,2004,38(1/2):145-148.

[4]Sganga G,Cozza V,Spanu T,et al.Global climate change and wound care:case study of an off-season vibrio alginolyticus infection in a healthy man[J].Ostomy Wound Manage,2009,55(4):60-62.

[5]Kelly GE,Lindsey JK.Robust estimation of the median lethal dose[J].J Biopharm Stat,2002,12(2):137-147.

[6]Devalaraja RM,Nanney LB,Du J,et al.Delayed wound healing in CXCR2 knockout mice[J].J Invest Dermatol,2000,115(2):234-244.

[7]Vieira SM,Lemos HP,Grespan R,et al.A crucial role for TNF-alpha in mediating neutrophil influx induced by endogenously generated or exogenous chemokines,KC/CXCL1 and LIX/CXCL5[J].Br J Pharmacol,2009,158(3):779-789.

[8]Su WL,Perng WC,Huang CH,et al.Identification of cytokines in whole blood for differential diagnosis of tuberculosis versus pneumonia[J].Clin Vaccine Immunol,2010,17(5):771-777.

[9]Wang T,Secombes CJ.Identification and expression analysis of two fish-specific IL-6 cytokine family members,the ciliary neurotrophic factor (CNTF)-like and M17 genes,in rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J].Mol Immunol,2009,46(11/12):2290-2298.

[11]Donlon TA,Krensky AM,Wallace MR,et al.Localization of a human T-cell-specific gene,RANTES (D17S136E),to chromosome 17q11.2-q12[J].Genomics,1990,6(3):548-553.

[12]孫敬，洪杰華，鄭世民．IL-12及其免疫調節作用[J]．動物醫學進展，2010，31(2)：111-114．

[13]袁群霞，李惠，單葵．慢性蕁麻疹疹患者外周血eotaxin、mcp-1的表達及意義[J]．重慶醫科大學學報，2010，35(12)：1888-1890．

[14]李靜，李玉琴．趨化因子eotaxin及其受體與支氣管哮喘[J]．國際兒科學雜志，2006，33(6)：406-408．

[15]馮獻啟，高美華，王海燕，等．GCSF在惡性卵巢腫瘤患者中表達的意義[J]．濱州醫學院學報，1999，22(5)：423．

[16]李玉芳，黃建寧，劉曉彥，等．粒細胞集落刺激因子在肝硬化失代償中的檢測及臨床意義[J]．寧夏醫學雜志，2000，22(8)：451-452．

[17]孫鑫波，劉朝東．MIP-1α與MMP-9在免疫炎癥反應中作用及其關系研究進展[J]．中國免疫學雜志，2012，28(5)：474-477．

[18]胡友瑩，趙金紅，汪雪峰，等．幽門螺桿菌相關性胃炎患者趨化因子IP-10、Mig的表達[J]．中國人獸共患病學報，2011，27(7)：641-644．

[19]趙金紅，王健，江水清，等．慢性乙型肝炎患者CXC趨化因子Mig的表達[J]．南方醫科大學學報，2006，26(11)：1589-1592.

The changes of inflammatory factors in mice infected with Vibrio alginolyticus*

WuJing,LiuXiaofei#,ZongYulong,CaoYuan,HuChengjin△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegionofPLA,Jinan,Shandong250031,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the changes of inflammatory factors in mice infected with Vibrio alginolyticus.MethodsEstablished a V.alginolyticus ATCC17749 T-infected mouse model through intraperitoneal injection,then performed the median lethal dose experiment,the detection of hematological and liver function indicators,histopathologic evaluation and inflammatory cytokine detection.ResultsThe median lethal dose of V.alginolyticus ATCC17749T was 1×109 CFU by intraperitoneal injection.The dose of 1×109 CFU per mouse was adopted in the following study.WBC and platelet numbers significantly decreased after infection (P<0.05),RBC number and hemoglobin content significantly increased(P<0.05) and ALT,AST significantly increased after V.alginolyticus infection(P<0.05);light microscopy observation revealed that,hepatic cell and pulmonary tissue suffered serious injury after infection。Through the detection of antibody array,the levels of 20 inflammatory factors were found changed significantly.8 of them including KC,IL-6,RNATES,IL-12,Eotaxin,G-CSF,MIP-1ɑ,Mig,the expression of which increased more than 10 times.ConclusionThe inflammatory factors analysed in the paper provide a theoretical basis for the study of the inflammatory mechanism of Vibrio alginolyticus infection.

Key words:Vibrio alginolyticus;animal experiment;inflammatory factors

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1017-03

基金項目：全軍醫學科技“十二五”重點項目(BWS12J014)。

作者簡介：武靜，女，檢驗醫師，主要從事海洋致病菌致病機制的相關研究；劉曉婓，女，主管檢驗師，主要從事海洋致病菌的致病機制及快速診斷的相關研究。#：并列第一作者?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:405045650@qq.com。