解脲支原體DNA檢測室內質控物的制備及質控方案的設計

葛燕梅，張　娣，樊蘇逸，袁　杭，毛　源

(南京金域醫學檢驗所,江蘇南京 210042)

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·論著·

解脲支原體DNA檢測室內質控物的制備及質控方案的設計

葛燕梅，張娣，樊蘇逸，袁杭，毛源△

(南京金域醫學檢驗所,江蘇南京 210042)

摘要:目的制備解脲支原體(UU)DNA熒光定量PCR室內質控物，建立室內質量控制體系，對其臨床應用進行初步評價。方法分別留取Ct值為24～25(陽性)和32～33(弱陽性)標本和檢測結果為陰性的標本，待留取到15 mL時充分混勻，按每管150 μL分裝作為室內質控物。前20次檢測采用“即刻法”判斷檢測結果是否在質控范圍內，20次以后繪制Levey-Jennings圖，確定靶值、標準差(s)和變異系數(CV)，采用Westdard多規則質控方法對自制室內質控物檢測結果進行判斷。在Unity Real Time(URT)系統中使用質控規則配置操作導出UU-DNA的功效函數圖(OPSPecs圖)，根據OPSPecs圖設置質控規則。結果131次實驗中，前20次采用“即刻法”判斷室內質控物；20次以后采用Levey-Jennings圖判斷，質控品穩定，質控規則合理。結論用臨床分泌物混合液制備UU-DNA檢測項目的室內質控物品，制備方法簡單，測定結果穩定，可作為實驗室檢測UU-DNA項目的質控品；依據OPSPecs圖設置分子生物學檢測項目的室內質控規則簡便、實用。

關鍵詞:解脲支原體；室內質控；質控圖；功效函數圖；質控規則

與常規PCR技術相比，實時熒光定量PCR具有高度的敏感性與特異性，這項檢測技術的出現使臨床對抗病毒治療療效判斷達到了核酸定量水平。盡管實時熒光定量PCR技術具有特異性強，能有效解決PCR產物污染和自動化程度高等特點，但嚴格的室內質量控制體系仍是臨床PCR實驗室不可忽視的問題[1-3]。由于目前尚無統一有效的室內質控品，因此臨床PCR實驗室需要建立符合本單位的室內質量控制體系。在總結多年PCR實驗室工作經驗的基礎上，筆者結合PCR實驗室工作的實際情況，自制了解脲支原體(UU)DNA室內質控物，繪制Levey-Jennings圖，采用Westdard多規則質控方法評價UU-DNA的室內質控動態[4-6]。而且在Unity Real Time(URT)系統中利用功效函數圖(OPSPecs圖)工具軟件進行質控規則的設計，選擇使用更加符合的分子項目的質控規則。

1材料與方法

1.1質控品來源收集實驗室標本中UU-DNA Ct值為24～25(陽性)和32～33(弱陽性)的陽性標本和檢測結果為陰性的標本。

1.2儀器與試劑試劑使用上?？迫A生物公司UU-DNA檢測試劑盒，儀器使用ABI公司的7300實時熒光定量儀。

1.3方法

1.3.1質控品的制備收集每天Ct值為24～25和32～33的陽性標本分別作為高值標本和低值標本，收集每天檢測結果為陰性的標本作為陰性質控標本，待留到15 mL時充分混勻，然后將標本進行每管150 μL分裝-20 ℃保存，每次實驗前將冷凍保存的標本各自取一管室溫復融20 min并充分混勻后與正常標本同樣進行檢測，記錄Ct值。

1.3.2PCR擴增按照試劑盒上的操作說明對標本進行DNA模板提取，反應體系為28 μL的擴增反應液和2 μL提取的DNA模板上清液。擴增結束后，按照儀器操作獲得質控結果和標準曲線，分別記錄高值質控品和低值質控品的Ct值。

1.3.4質控規則采用的是Westdard多規則質控方法：如果陰性質控標本的檢測結果為陽性，判斷為失控，所有陽性標本均進行重新檢測，并增加一定數量的陰性質控標本。如陰性質控標本檢測結果為陰性，陽性質控檢測結果為陽性，并且測得的高值質控品和低值質控品的要滿足筆者利用OPSPecs圖工具軟件設計的質控規則。

2結果

2.1采用“即刻法”判斷質控結果用PCR連續對自制的陽性和弱陽性質控標本檢測20次，采用“即刻法”判斷質控結果，結果在控，見表1、2(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.2根據OPSPecs圖得出建議質控規則連續檢測100次后，在URT系統中使用質控規則配置操作導出UU-DNA的OPSPecs圖，見圖1、2，根據OPSPecs圖可得出建議的質控規則。得出的質控規則與項目的總允許誤差(TEa)、偏倚(%)和變異系數(CV)等有關。UU-DNA陽性質控的TEa為12.8，偏倚(%)為0，CV為4.26%。UU-DNA弱陽性質控的TEa為8.96，偏倚(%)為0，CV為2.96。建議規則均為：1-3s|2-2s|R-4s|4-1s|10-X。

圖1　　UU-DNA陽性質控OPSPecs圖

圖2　　UU-DNA弱陽性質控OPSPecs圖

2.3質控品的Levey-Jennings圖本批自制的陽性和弱陽性質控品，總共進行131次室內質控檢測，根據質控規則，結果都在控。131次室內質控陽性和弱陽性質控品Levey-Jennings圖，見圖3、4(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.4陰性質控品的檢測自制的陰性質控品，總共進行131次室內質控檢測，Ct值均顯示為“未檢出”，根據質控規則，陰性質控品結果都在控。

3討論

近年來，臨床實驗室的管理越來越規范，尤其是臨床基因擴增實驗室的質量管理日益受到關注。而實驗室要獲得可靠的檢測結果，必須要建立有效的質量管理體系，其中實驗室室內質量控制是保證檢驗質量的一個重要環節[5]。在對臨床標本進行檢測的同時，需要進行室內質量控制來確保檢測結果的準確性。

用于臨床基因擴增實驗室室內質控的理想質控品應具備以下幾個條件：(1)基質與待測標本一致；(2)所含待測物濃度應接近試驗的決定性水平；(3)有很好的穩定性；(4)靶值或預期結果已定；(5)無已知的生物傳染危險性；(6)單批可大量獲得[7]。由于現在商品化的質控品尚不齊全，各實驗室須根據自己實驗室的實際情況自行制備質控品。

UU支原體感染是近年來國內外最常見的性傳播疾病之一[8]，臨床多用熒光定量PCR方法檢測UU-DNA。本實驗室在檢測過程中發現UU-DNA陽性檢出率較高，陽性標本易于收集，而且UU-DNA送檢標本多為用無菌拭子取的臨床分泌物混合液，易于采集?；诖朔N情況，建議將日常收集的UU-DNA陽性標本(Ct值為24～25)作為室內質控陽性標本，UU-DNA陰性標本作為室內質控陰性標本，而且考慮到檢測的臨界值，筆者也收集了UU-DNA弱陽性標本(Ct值為32～33)作為室內質控弱陽性標本。

筆者將收集的UU-DNA不同結果的標本分別充分混勻后，按每管150 μL用離心管分裝好，-20 ℃保存。連續檢測20次，用“即刻法”判斷結果是否在控，第21次開始采用“Levey-Jennings圖質控法”，用前20次檢測結果計算得出的 和s繪制Levey-Jennings圖，判斷結果是否在控，采用的是Westdard多規則質控方法進行評價。 在設計質控方法時，首先要確定質量目標。質量目標可以用TEa的形式表示，目前中國尚未確立各項目的TEa[9]。本實驗室設置的TEa來源為3 s。在檢測次數達到100次以后，筆者使用URT系統中，質控規則配置操作導出UU-DNA的OPSPecs圖，根據OPSPecs圖評價誤差檢出概率和假失控概率，確定新的質控方法。本研究中根據OPSPecs圖得出建議的質控規則1-3s|2-2s|R-4s|4-1s|10-X；n=2，然后將此規則應用到UU-DNA質控品的結果判斷，切合實際且能達到臨床工作發現誤差的要求，同時假失控率也控制在合適的水平。

本研究對收集到的陽性、弱陽性和陰性3個不同濃度的標本共進行了131次檢測，每周進行3次檢測，連續進行了10個月的時間，檢測結果仍然比較穩定，因此可以考慮將自制的UU-DNA標本混合液作為PCR實驗室UU-DNA檢測的室內質控物。

參考文獻

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Preparation of internal quality control substance of real-time PCR to analyze UU-DNA and the design quality control programs

GeYanmei,ZhangDi,FanSuyi,YuanHang,MaoYuan△

(MedicalLaboratoryofNanjingKingmed,Nanjing,Jiangsu210042，China)

Abstract:ObjectiveDeveloping an internal quality control substance of Ureaplasma urealyticum(UU)-DNA for real-time PCR to establish an internal quality control system and preliminary evaluation its clinical value.MethodsInternal quality control substance was prepared by mixing samples which Ct value were 24-25(positive sample) and 32-33(weak positive sample),respectively.At the same time,selecting samples that test results were negative as negative control.The target value,standard deviation(s) and coefficient of variation(CV) of internal quality control substance were defined by “instant method” for the first 20 runs and Levey-Jennings quality control(QC) chart after the first 20 runs.Using the “Westdard” multi-rule quality control methods to analyze the detection results.Exporting OPSPecs chart by quality control rules in Unity Real Time (URT) system and setting up new quality control rules according with OPSPecs chart.Results131 times of the detection of quality control substance were performed totally.The first 20 runs were defined by “instant method” and later 111 runs were defined by Levey-Jennings QC chart,the results were stable of quality control substance and reasonable quality control rules.ConclusionPreparing of internal quality control substance of UU-DNA used in real-time PCR might be easy and stable.So,the internal quality control substance of UU-DNA could be worthy for practical application in this PCR laboratory.Design internal quality control rules based OPSPecs chart in molecular detection is very simple and practical.

Key words:Ureaplasma urealyticum;internal quality control;quality-control chart;OPSPecs chart;quality-control rules

(收稿日期：2015-12-08)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.022

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1070-03

作者簡介：葛燕梅，女，碩士，主要從事分子診斷學的研究。△通訊作者，E-mail:LABMY@kingmed.com.cn。