產AmpC酶大腸埃希菌的檢測及耐藥分析

王欣慧，許可欣

(南京醫科大學第二附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210011)

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產AmpC酶大腸埃希菌的檢測及耐藥分析

王欣慧，許可欣△

(南京醫科大學第二附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210011)

摘要:目的檢測臨床分離細菌中大腸埃希菌的AmpC β-內酰胺酶(簡稱AmpC酶)及其耐藥情況。方法收集臨床上藥敏試驗頭孢西丁抑菌圈直徑≤18 mm的大腸埃希菌299株，三維試驗篩選產AmpC酶大腸埃希菌，多重PCR擴增產AmpC酶的基因。最低抑菌濃度法檢測抗菌藥物的敏感性。結果AmpC酶初篩試驗陽性的299株大腸埃希菌中，56株(18.73%)三維試驗篩選陽性，多重PCR試驗陽性共34株，其中DHA群的有14株，CIT群的有20株。結論大腸埃希菌臨床菌株中AmpC酶仍有較高的分離率，本研究中以DHA群和CIT群為主，并且耐藥情況越來越嚴重。

關鍵詞:大腸埃希菌;AmpC β-內酰胺酶;ampC

大腸埃希菌的分離率始終最高，從近年我國發布的耐藥監控數據分析來看，其耐藥率也逐年增加[1-3]。細菌因產生各種β-內酰胺酶導致的耐藥現象隨著β-內酰胺類抗菌藥物的廣泛應用日趨嚴重，酶的水解作用已成為耐藥增加的一個重要原因，尤其以產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)、AmpC酶β-內酰胺酶(AmpC酶)最為常見。其中AmpC酶已是腸桿菌科細菌對β-內酰胺類抗菌藥物產生多重耐藥的重要原因之一[4]。AmpC酶的產生使細菌對包括青霉素和除頭孢匹羅和頭孢吡肟以外幾乎全部的頭孢菌素類藥物產生耐藥，另有報道，由于伴有ESBLs，產AmpC酶的大腸埃希菌出現了對廣譜頭孢菌素的耐藥性[5]。種間傳播性是質粒介導的AmpC酶具有的特征，不論其在細菌耐藥機制還是在院內感染方面都有重要的意義。目前，對于AmpC酶產生耐藥的檢測仍然沒有方法學的臨床和實驗室標準協會(CLSI)指導標準[6]，臨床常規檢測項目中也沒有對產AmpC酶的大腸埃希菌檢測。因此，筆者對臨床菌株產AmpC酶的情況及其耐藥情況用進行了調查和分析，旨在為相關研究提供參考。

1材料與方法

1.1菌株從臨床痰、尿等標本中分離得到且篩選出頭孢西丁抑菌圈直徑小于等于18 mm 299株，無重復的菌株。用大腸埃希菌ATCC 25922作為產AmpC酶的陰性對照株，以產AmpC酶陰溝腸桿菌(029M)作為產AmpC酶的陽性對照株。

1.2儀器與試劑試驗藥敏紙片購自Oxoid公司；藥敏試驗板購自上海復星佰珞生物技術有限公司，PCR擴增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；引物合成于上海生工生物公司。使用的儀器包括微生物鑒定藥敏系統、Mastercycle梯度PCR儀、 Tanon Eps100電泳儀、凝膠成像儀、高速離心機、加熱儀器、37 ℃孵箱。

1.3方法

1.3.1AmpC酶的初篩試驗用微生物鑒定藥敏系統對菌株進行鑒定，篩選出頭孢西丁抑菌圈直徑≤18 mm的大腸埃希菌。

1.3.2三維試驗篩選反復凍融提取酶粗提物，大腸埃希菌 ATCC 25922菌液涂布M-H瓊脂培養基，將頭孢西丁紙片貼在培養基中心，沿紙片邊緣向外劃線加入酶粗提物，35 ℃孵育16～18 h[7]。

1.3.3多重PCR方法檢測AmpC酶加熱裂解方法提取細菌DNA，配制PCR的反應體系共50ul，分群特異性的引物6對[8]，見表1。多重PCR的反應條件是94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。

表1　　PCR引物序列及擴增片段長度

1.3.4微量肉湯稀釋法按照CLSI推薦使用MIC法檢測待檢大腸埃希菌對抗菌藥物的敏感性。稀釋后菌液順次加入含有不同濃度藥物的96孔板中，設有陽性和陰性對照孔。37 ℃培養20～22 h進行結果觀察。

2結果

2.1三維試驗對初篩試驗陽性的菌株進行三維試驗，得到三維試驗陽性共56株，其陽性率為18.73%(56/299),見圖1。

1、2:三維試驗陰性；3:為三維試驗陽性。

圖1三維試驗結果

2.2多重PCR試驗對三維試驗陽性的大腸埃希菌進行多重PCR試驗，多重PCR試驗陽性共34株，其中DHA群的有14株，CIT群的有20株，見圖2。

1、2、5:DHA群；3、4:CIT群。

圖2多重PCR試驗結果圖

2.3MIC法藥物敏感試驗篩選出的34株大腸埃希菌的MIC法藥物敏感試驗結果，見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)，這些大腸埃希菌對AMP、KZ、CXM、CTX的耐藥率均為100%，對FEP的耐藥率高達58.8%,另外對CIP、PRL和CAZ的耐藥率分別高達91.2%、94.1%和97.1%和，對AK的耐藥率為23.5%，而對碳青霉烯類抗菌藥物如MEM和IPM耐藥率相對較低分別為8.8%和11.8%。

3討論

大腸埃希菌為臨床分離革蘭陰性桿菌引起感染中最常見，可見于泌尿道、傷口、呼吸道、膽道和腦膜等部位，隨著抗菌藥物在臨床的廣泛應用耐藥現象不斷增加[9]。各種因β-內酰胺酶引起的耐藥中AmpC酶已成為腸桿菌科細菌對β-內酰胺類抗菌藥物產生多重耐藥的重要原因之一。

目前國際上檢測AmpC酶的方法有很多，三維試驗是公認可以使用的方法，本研究三維試驗陽性率為18.73%(56/299)。質粒介導的AmpC酶至少被歸為CIT、DHA、MOX、EBC、FOX和ACC六個主要群，本研究中以DHA群和CIT群為主，可見DHA群和CIT群是臨床中產AmpC酶大腸埃希菌的常見基因型。

通過對篩選出的34株產AmpC酶大腸埃希菌進行藥物敏感試驗，得出一、二、三代頭孢中這些產AmpC酶大腸埃希菌均有高的耐藥率，這也與AmpC酶可水解第一、二、三代頭孢菌素的報道一致[10]。另外，對AMP、PRL和CIP的耐藥率也分別高達100%、94.1%和91.2%。本實驗結果顯示一直對產AmpC酶的大腸埃希菌有高敏感率的四代頭孢如FEP的耐藥率竟然高達58.8%。當前因產生AmpC酶而出現對一代、二代和三代頭孢耐藥的感染性疾病治療最為有效的抗菌藥物是碳青霉烯類抗菌藥物如IPM和MEM，耐藥率相對較低分別為11.8%和8.8%?？梢姡委熞虍aAmpC酶的細菌引起的感染性疾病中可用抗菌藥物的選擇范圍變得非常小，要控制抗生素使用和加強產酶菌監測，否則一旦繼續濫用抗菌藥物就會出現無藥可用。

伴著細菌出現高耐藥率，一方面揭示了細菌的耐藥性正在增強，這樣發展下去，對感染性疾病的治療極可能無藥可用；另一方面，雖然AmpC酶被認為是革蘭陰性細菌尤其是腸桿菌科細菌產生耐藥的重要機制，但隨著更深入的研究發現膜通透性降低、泵外排作用和青霉素結合蛋白的改變等機制在細菌產生耐藥過程中也起著至關重要的作用，同時，也正是存在各種機制的協同作用導致了耐藥現象更為嚴重。

參考文獻

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(收稿日期：2016-01-10)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.041

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1112-03

△通訊作者,E-mail：sunshinexu1988@163.com。

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